沈 景，宋利強(qiáng)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院病理系，北京 100005

·技術(shù)與方法·

改良TRIzol法提取腫瘤細(xì)胞瓊脂克隆的總RNA

沈 景，宋利強(qiáng)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院病理系，北京 100005

TRIzol；瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)；RNA提??；多糖

瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)是腫瘤研究領(lǐng)域中一種重要的體外實(shí)驗(yàn)，可用于篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞、評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞藥物敏感性[1]等。有研究表明，瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)篩選的腫瘤細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性[2]，有更強(qiáng)的致瘤性和轉(zhuǎn)移能力[3]。因而腫瘤細(xì)胞瓊脂克隆的基因表達(dá)分析，對(duì)研究腫瘤干細(xì)胞的基因表達(dá)特征、分子標(biāo)志及耐藥機(jī)制有重要意義。但提取的瓊脂克隆RNA被瓊脂糖嚴(yán)重污染，瓊脂糖又阻礙逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)行[4-5]，使所提RNA難以用于基因表達(dá)分析。本實(shí)驗(yàn)將F9細(xì)胞與瓊脂糖凝膠混合以模擬瓊脂克隆，以建立有效去除瓊脂糖污染、提取高質(zhì)量RNA的方法,并通過(guò)提取M5076瓊脂克隆的RNA進(jìn)行驗(yàn)證。

材料和方法

材料F9小鼠畸胎瘤細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心；M5076小鼠卵巢網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤細(xì)胞株由美國(guó)癌癥研究所贈(zèng)送； PBS、細(xì)胞培養(yǎng)基及血清購(gòu)自Hyclone公司； TRIzol 總RNA提取試劑、低熔點(diǎn)超純瓊脂糖購(gòu)自上海英駿公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司。

F9細(xì)胞總RNA的提取將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的F9細(xì)胞收集至離心管，約4×107細(xì)胞沉淀與1.5 g 1%的瓊脂糖凝膠混合，加入13 ml TRIzol裂解細(xì)胞，取其中12 ml分裝入12個(gè)無(wú)RNA酶的 1.5 ml離心管，分成對(duì)照組、PBS預(yù)處理組、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)水預(yù)處理組和0.2 mol/L醋酸鉀溶液預(yù)處理組，每組3管。對(duì)照組直接用TRIzol提取RNA；其他3組每管緩慢加入1/4體積預(yù)冷至4℃的相應(yīng)預(yù)處理液，-80℃放置30 min， 4℃、12 000×g離心10 min后取上清，再按TRIzol說(shuō)明書進(jìn)行提取。

軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)將M5076單細(xì)胞懸液接種于6孔板的雙層瓊脂培養(yǎng)基中，底層、上層瓊脂糖濃度分別為0.6%和0.5%。每孔加入0.5 ml含17%馬血清的1640培養(yǎng)基，隔天換液，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 d[6]。

M5076細(xì)胞瓊脂克隆RNA的提取將瓊脂克隆挑出，加入5倍體積的TRIzol裂解細(xì)胞，分裝入無(wú)RNA酶的 1.5 ml離心管。每管加入1/4體積預(yù)冷至4℃的PBS，-80℃放置30 min， 4℃、12 000×g離心10 min后取上清，按TRIzol說(shuō)明書進(jìn)行提取。

RNA純度和質(zhì)量鑒定檢測(cè)RNA紫外吸收特性，以A260/A280評(píng)估蛋白質(zhì)污染、A260/A230評(píng)估多糖及酚類污染；甲醛變性膠電泳檢測(cè)RNA有無(wú)降解； RT-PCR檢測(cè)RNA能否用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，擴(kuò)增的基因?yàn)镚APDH，引物序列為：上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’;下游引物 : 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。 PCR反應(yīng)條件為：95℃變性30 s, 68℃復(fù)性30 s, 68℃延伸90 s， 35個(gè)循環(huán)后72℃延長(zhǎng)10 min，于4℃保存。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為Plt;0.05。

結(jié) 果

F9細(xì)胞RNA純度和完整性對(duì)照組RNA樣品中，瓊脂糖與RNA共沉淀導(dǎo)致RNA沉淀難于溶解，加熱助溶后又形成凝膠，只得到少量的RNA溶液。對(duì)照組、各預(yù)處理組的A260/A280均大于1.8；對(duì)照組A260/A230為0.76±0.20，各處理組均大于2.0;對(duì)照組A260/A230與PBS組、DEPC水組、醋酸鉀溶液組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P=0.009，P=0.038)。變性膠電泳顯示，各預(yù)處理組均得到了清晰的28S、18S核糖體RNA條帶，其亮度比約為2∶1；醋酸鉀溶液處理組有基因組DNA污染及RNA降解；DEPC水處理組亦有少量基因組DNA污染(圖1)。

M5076瓊脂克隆RNA純度和完整性M5076細(xì)胞瓊脂克隆3個(gè)重復(fù)樣品總 RNA的A260/A280分別為1.97、1.97、1.96，均大于1.9；A260/A230為2.25、2.26、2.3，均大于2.2。變性膠電泳顯示， 28S和18S 核糖體RNA條帶清晰，亮度約為2:1(圖2)。

RT-PCR檢測(cè)M5076瓊脂克隆RNA的生物活性總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，通過(guò)PCR擴(kuò)增了451bp的GAPDH基因片段(圖3)。

1：對(duì)照組；2：PBS預(yù)處理組；3：焦碳酸二乙酯水預(yù)處理組；4：醋酸鉀溶液預(yù)處理組圖1 F9細(xì)胞對(duì)照組和各處理組RNA電泳

1、2、3為3個(gè)重復(fù)樣品圖2 M5076瓊脂克隆總RNA電泳

1、2、3為3個(gè)重復(fù)樣品圖3 RT-PCR擴(kuò)增的GAPDH基因片段

討 論

根據(jù)干細(xì)胞領(lǐng)域的理論，瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆，一旦轉(zhuǎn)到普通平皿中培養(yǎng)即發(fā)生分化而失去干細(xì)胞特性[7]，基因表達(dá)特征隨之改變。因而，直接提取瓊脂克隆的RNA做基因芯片、逆轉(zhuǎn)錄 PCR等基因表達(dá)分析，對(duì)研究腫瘤干細(xì)胞的基因表達(dá)特征具有重要意義。提取瓊脂克隆RNA的難點(diǎn)，在于瓊脂糖能與RNA共沉淀[4]，商業(yè)化試劑盒均無(wú)法將其有效去除[8]。

F9細(xì)胞模擬瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)中， PBS去除瓊脂糖污染的效果比DEPC水、醋酸鉀溶液為好，因此本實(shí)驗(yàn)建立了一種通過(guò)PBS稀釋TRIzol細(xì)胞裂解液、-80℃冷凍、低溫高速離心等手段去除瓊脂糖污染的方法，提取了M5076腫瘤細(xì)胞瓊脂克隆的高質(zhì)量RNA，并以RT-PCR方法驗(yàn)證了所提RNA能夠用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。本方法將為腫瘤細(xì)胞瓊脂克隆的基因表達(dá)研究提供有力的工具，對(duì)干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞領(lǐng)域的研究提供幫助，也對(duì)某些富含多糖植物的RNA提取有一定的啟示。

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沈 景 電話：010-65295992，電子郵件：sdshenjing@163.com

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2011-03-28)