應瓊瓊 劉 婷 顧 蔚 (陜西師范大學生命科學學院，陜西 西安 710062)

紫外線照射對果蠅凋亡相關(guān)基因reaper、grim、hid表達的影響

應瓊瓊 劉 婷 顧 蔚 (陜西師范大學生命科學學院，陜西 西安 710062)

目的 探討紫外線照射對果蠅凋亡相關(guān)基因reaper(rpr)，grim，hid表達的影響。方法 收集8 h內(nèi)羽化果蠅，雌雄分開培養(yǎng)至10日齡，紫外線照射0，0.5，1，1.5，2 h。提取果蠅總RNA，運用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法檢測各組果蠅rpr、grim、hid基因的表達。結(jié)果 對照組果蠅rpr、grim、hid基因表達較弱，照射后rpr、grim、hid基因的表達量呈現(xiàn)先增后減的趨勢。結(jié)論 紫外線照射可增加果蠅凋亡相關(guān)基因rpr，grim，hid的表達，可能是其誘導細胞凋亡的分子機制之一，但照射達到一定時間，基因表達減弱，可能是其引起衰老的原因。

紫外線照射;黑腹果蠅;凋亡相關(guān)基因;基因表達

紫外線照射會影響果蠅幼蟲的細胞形態(tài)，并且影響細胞分裂〔1〕，會損傷果蠅基因組 DNA，從而引起更多的細胞凋亡〔2〕，顯著降低果蠅壽命和繁殖力，對求愛行為也會產(chǎn)生不利影響〔3〕，連續(xù)照射果蠅三代，結(jié)果顯示子代數(shù)量減少，羽化時間縮短，體重減輕，具有致畸和間接誘變效應〔4〕。機體通過凋亡的方式清除受損細胞，短時間的紫外線照射會引起果蠅損傷修復能力的增強〔5〕，若照射時間過久這種損傷沒有及時修復，會導致基因突變，細胞癌變或死亡，從而誘發(fā)癌癥〔6〕。因此，有關(guān)紫外線誘導細胞凋亡的分子機制成為此領(lǐng)域研究熱點。輻射會引起果蠅細胞凋亡的變化，但對其規(guī)律及相關(guān)基因的表達目前沒有足夠的分析，因此本實驗通過紫外線照射處理果蠅，從mRNA水平上來探討其對果蠅凋亡相關(guān)基因rpr，grim，hid表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 野生型黑腹果蠅Canton-S品系，培養(yǎng)于恒溫恒濕培養(yǎng)箱，(25±1) ℃，相對濕度(RH)60% ～75%，12 L：12 D。

1.2 試劑與儀器 Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit、Taq酶、dNTP均購自TaKaRa公司;氯仿、異丙醇、無水乙醇均為分析純。254.7 nm紫外燈(220 V，15 W);Microfuge 22 R離心機、DU 730核酸/蛋白分析儀，BECKMAN公司;PTC-200 PCR，BIORAD公司;Tanon-1600全自動數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制 本實驗果蠅采取玉米-糖-酵母(CSY)基本培養(yǎng)基培養(yǎng)〔7，8〕。

1.3.2 紫外線照射 收集基本培養(yǎng)基中8 h內(nèi)羽化未交配的果蠅，按雌雄隨機分管培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)至10日齡后進行紫外線照射。每組雌雄果蠅各20只，放在培養(yǎng)皿中，表面覆蓋一層有孔薄膜，置于紫外光源下15 cm處分別照射 0，0.5，1，1.5，2 h。

1.3.3 果蠅rpr，grim，hid基因表達的檢測 采用Trizol常規(guī)一步法提取總RNA，測定RNA樣品純度，取總RNA 1 μg，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物由上海生工公司合成，以GAPDH作為內(nèi)參基因。引物序列如下，rpr上游引物：5'-TGGCAGTGGCATTCTACATACC-3'，下游引物：5'-ATCCTCATTGCGATGGCTTG-3'，退火溫度：64℃，擴增片段長度：296 bp。grim上游引物：5'-GTTCGTCAAAAAGCGACAAGTT-3'，下游引物：5'-TGGCCATGGCGGTATTTAAT-3'，退火溫度：55℃，擴增片段長度：253 bp。hid上游引物：5'-GCAGGAAGGAAGGAAGCGGATAAG-3'，下游引物：5'-GAGGTGGTGGTGTTCGGCGATT-3'，退火溫度：66 ℃，擴增片段長度：201 bp。GAPDH上游引物：5'-TGGGATACACCGATGAGG-3'，下游引物：5'-TGTGGGTGGGTAGTGTTCTT-3'，退火溫度：54℃，擴增片段長度：220 bp。PCR反應體系：10×PCR Buffer 2.0 μl，Mg2+1.2 μl，Taq 酶 0.2 μl，dNTPs 0.8 μl，模板 cDNA 1.0 μl，上下游引物各 0.4 μl，加滅菌蒸餾水補充至20 μl。PCR反應程序：95℃預變性5 min;95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸20 s，共35個循環(huán);最后72℃延伸5 min。取5 μl PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。所有樣本均取樣3次，進行3次RT-PCR分析，要求相同結(jié)果需達到2次以上。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量檢測 用核酸∕蛋白分析儀檢測總RNA，其OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，符合后續(xù)分子生物學實驗要求。瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測到28 S、18 S、5 S三條帶，且18 S較寬較亮，28 S與5 S亮度接近，弱于18 S，RNA結(jié)構(gòu)基本保持完整，DNA與蛋白質(zhì)的污染極少，表明抽提到較高質(zhì)量的總RNA(圖1)。

2.2 內(nèi)參基因GAPDH的表達 紫外線照射前后，均擴增出GAPDH基因，片段大小為220 bp，與預期相同(圖2)，且在各樣本中表達均一，表明該內(nèi)參基因及RT-PCR體系符合半定量表達分析的要求。

2.3 果蠅rpr基因的表達 對照組果蠅rpr基因表達非常弱，照射后rpr基因表達量顯著增加(圖2)，雄蠅照射1.5 h表達量最高，2.0 h時表達量下調(diào)回對照組水平，雌蠅照射0.5 h表達量最高，隨時間延長表達量略有下調(diào)。

2.4 果蠅grim基因的表達 對照組果蠅grim基因表達非常弱，照射后grim基因表達量顯著增加(圖2)，雄蠅照射1.0，1.5 h表達量最高，雌蠅照射0.5，1.0，1.5 h表達量最高，2.0 h時均下調(diào)回對照組水平。

2.5 果蠅hid基因的表達 對照組果蠅hid基因表達較弱，照射后hid基因表達量顯著增加(圖2)，雄蠅照射0.5 h表達量最高，1.5 h時表達量下調(diào)回對照組水平，雌蠅照射1.0 h表達量最高，2.0 h時表達量均顯著下調(diào)。

圖1 果蠅總RNA

圖2 紫外線照射后果蠅體內(nèi)GAPDH、rpr、grim、hid基因的表達

3 討論

本文結(jié)果表明紫外線照射可以誘導rpr，grim，hid的表達，導致細胞凋亡，從而修復造成的損傷。但當照射達到一定時間，損傷程度超過了生物體修復能力，凋亡基因的表達減弱甚至低于正常水平，組織、器官的功能就逐步發(fā)生障礙，導致壽命降低，與本實驗室前期所證實的γ射線照射雄蠅能顯著縮短其壽命相符〔8〕。Bergmann等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅的發(fā)育進程中，rpr和grim僅在將要死亡的細胞中表達，而hid可以在正常存活的細胞中表達，與本文結(jié)果一致。有關(guān)衰老機制的學說認為，體內(nèi)某種程度的損傷不斷累積，能影響細胞功能，導致細胞凋亡，最終造成衰老，實驗結(jié)果顯示對照組雄蠅rpr、grim、hid基因表達量高于雌蠅，間接表明雄蠅體內(nèi)細胞凋亡的程度高于雌蠅，這就和雄蠅壽命普遍低于雌蠅相一致。果蠅體內(nèi)hid基因?qū)ψ贤饩€照射的耐受程度可能低于rpr和grim基因。此外，雌雄果蠅的rpr、grim、hid基因表達量達到最高時所對應的紫外線照射時間各不相同，這可能與雌雄個體內(nèi)該基因?qū)ψ贤饩€照射的敏感度不同有關(guān)，雌蠅體內(nèi)rpr、grim基因?qū)ψ贤饩€刺激的敏感度高于雄蠅，而hid基因剛好相反。由本實驗可得出，紫外線照射能影響果蠅凋亡相關(guān)基因rpr、grim、hid表達，照射一定時間，基因表達減弱，進而導致生物體機能紊亂，機體逐漸趨于衰老。高強度的紫外線照射會對人皮膚產(chǎn)生紅斑效應，導致皮膚癌〔6〕，還可損傷呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及誘發(fā)白內(nèi)障等諸多疾病〔10〕。因此紫外輻射對于生物體的影響效應越來越多的受到關(guān)注和重視。

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Effect of ultraviolet irradiation on the expressions of apoptosis related genes reaper，grim，hid in Drosophila YING Qiong-Qiong，LIU Ting，GU Wei.

College of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，Shaanxi，China

Objective To study the effect on the expressions of apoptosis related genes reaper(rpr)，grim，hid in Drosophila melanogaster after ultraviolet irradiation.Methods The flies of Drosophila were collected within 8 hours after eclosion.After cultured on standard medium for 10 days，flies were exposed to ultraviolet for different times(0.0 ，0.5，1.0，1.5，2.0 h).Then the total RNA from flies were extracted.The expressions of genes rpr，grim，hid were detected by Reverse Transcription PCR(RT-PCR).Results In the control group，the expressions of apoptosis related genes rpr，grim，hid in Drosophila were weak.After ultraviolet irradiation，the expressions of genes rpr，grim，hid were increased at first and then decreased.Conclusions Ultraviolet irradiation can enhance the expressions of apoptosis related genes rpr，grim，hid in Drosophila，which may be one of the molecular mechanisms of apoptosis induced by ultraviolet.But after a certain time exposure，expressions are decreased，which may be the cause of aging.

Ultraviolet irradiation;Drosophila melanogaster;Apoptosis related gene;Gene expression

Q786

A

1005-9202(2012)11-2307-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.11.044

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(GK201002042)

顧 蔚(1963-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事發(fā)育遺傳與衰老研究。

應瓊瓊(1988-)，女，在讀碩士，主要從事發(fā)育遺傳學研究。

〔2011-07-27收稿 2011-12-12修回〕

(編輯 曹夢園)