陜西省寶雞市中心醫(yī)院（寶雞721008） 樊冬梅 薛 莉

心肌梗死后普遍伴隨著左心室重塑，指的是左室腔、幾何結(jié)構(gòu)和功能的改變。左心室重塑是一個慢性進(jìn)展過程，心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)遞進(jìn)性改變，導(dǎo)致左室的擴(kuò)大、收縮功能的下降和潛在的室性心律失常、心衰、和隨后心血管性猝死［1］。心室重塑過程的具體機(jī)制不斷得到闡明，其中炎癥反應(yīng)和其細(xì)胞因子的作用越來越受到重視。本研究應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)染色觀察急性心肌梗死（AMI）后心室重塑患者外周血單個核細(xì)（PBMCs）的核因子-kappaB（NF-κB）活性及其與血漿細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）分泌的相關(guān)性來探討心室重塑的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1 一般資料 急性心肌梗死患者來自我院2008年12月至2009年9月心內(nèi)科住院病人，共58例，AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)1981年WHO制定心肌梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)。心功能采取killip分級法，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級。所有受試者均除外陳舊性心肌梗死、其他心臟病、各種炎癥、惡性腫瘤、風(fēng)濕活動、內(nèi)分泌疾病等。以左心室舒張末期容積指數(shù)增加率（ΔLVEDVI）＞20%作為AMI后心室重塑的分組標(biāo)準(zhǔn)［2］：A組：左心室重塑組（ΔLVEDVI＞20%）33例，男20例，女13例，平均年齡為59.7±8.4；B組：非左心室重塑組（ΔLVEDVI≤20%）25例，男15例，女10例，平均年齡為58.6±5.9。另取門診體檢健康者為C組：20例，男性12例，女性8例，平均年齡57.8±6.5歲。

2 方 法

2.1 試劑及儀器 ：淋巴細(xì)胞分離液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）、1640培養(yǎng)基（Sigma Co）、小牛血清（FCS）（鄭州佰安生物工程有限公司）、細(xì)胞離心機(jī)cytospin-2型（British.SHANDON）、NF-kB（p50）兔抗、鏈酶親和素一生物素過氧化物酶試劑盒（SABC），試劑盒（單克隆鼠抗兔）及DAB試劑盒均購自武漢博士德公司。TNF-α、IL-1β放免試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放射免疫研究所。

2.2 標(biāo)本采集：采血均得到患者同意，用肝素鋰5ml真空采血管無菌采取確診AMI患者發(fā)病的3d及14d空腹靜脈血5ml。

2.3 外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）的分離：取抗凝3ml血液用磷酸緩沖液（PBS）1∶1稀釋后，以2∶1體積置于淋巴細(xì)胞分離液上，3000r／min離心30min，收集試管中間懸浮的一層乳白色的液體，即為外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）。再以磷酸緩沖液（PBS）洗滌3次，每次1000r／min離心5min。用臺盼藍(lán)拒染試驗活細(xì)胞比例大于95%為有效標(biāo)本。1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為25×107個／ml，取100ul細(xì)胞混懸液滴入細(xì)胞離心機(jī)600r／min，離心6min，使細(xì)胞甩于載玻片上，室溫下自然風(fēng)干，丙酮固定5min，干燥后保存于-70℃冰箱待測NF-κB活性。

2.4 NF-κB的免疫組化染色（SABC法）：第一抗體選用兔抗NF-κBp50亞單位的多克隆抗體，抗體稀釋度經(jīng)預(yù)實驗定為1×100，二抗為生物素化單克隆小鼠抗兔IgG，采用SABC法試劑盒檢測。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，每張涂片隨機(jī)選取5個不重疊的高倍鏡視野，隨機(jī)計數(shù)500個細(xì)胞，計算細(xì)胞核陽性的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果判定：PBS代替一抗為空白對照，細(xì)胞染色為棕黃色者為陽性，定位于胞質(zhì)與胞核。PBMCs中NF-κB的活化水平用NF-κB（+）cells占所有定量化的PBMCs的百分比來表達(dá)。即陽性率＝陽性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%

2.5 血漿細(xì)胞因子的測定：取出2ml血液置于離心管中，以2500r／min離心20min，取上層血漿置于-70℃冰箱保存，待測細(xì)胞因子（TNF-α，IL-1β）；利用液相競爭抑制原理，采用平衡法對樣品進(jìn)行測定。將待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)與限量的抗血清及標(biāo)記的抗原加在一起進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)，加入免疫分離劑分離出抗原抗體復(fù)合物，測定復(fù)合物的放射性（B），計算各標(biāo)準(zhǔn)管的結(jié)合率（B／B0%.）做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，由GC-1200r放射免疫計數(shù)器查出樣品濃度。

2.6 超聲心動圖檢查：所有患者入院后第3天和第30天進(jìn)行超聲心動圖檢查，測定左心室舒張末期內(nèi)徑（LVED）。按Simpson法計算左心室舒張末期容積（LVEDV），經(jīng)體表面積校正后計算出左心室舒張末期容積指數(shù)（LVEDVI），并進(jìn)一步計算出ΔLVEDVI ＝（30dLVEDVI-3dLVEDVI） ／3dLVEDVI×100%。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 11.5分析軟件，計量資料均采用±s表示，計數(shù)資料用χ2檢驗，三組間細(xì)胞因子比用單因素方差分析；PBMC的NF-κB與細(xì)胞因子間的相關(guān)程度采用直線相關(guān)性分析法；進(jìn)行統(tǒng)計處理，顯著性檢驗水準(zhǔn)取a＝0.05。

結(jié) 果

1 NF-κB檢測結(jié)果 AMI后重塑組血漿TNF-α、IL-1β和外周血單個核細(xì)胞NF-κB核染色陽性百分率測量結(jié)果均顯著高于未重塑組、健康對照組（見表1及附圖）。AMI后重塑患者外周血單個核細(xì)胞NF-κB核染色陽性百分率為顯著高于未重塑組、健康對照組3d三組分別：26.0%±7.60%，22.30%±5.46%、10.05%±5.23%；14d：20.45%±5.46%、13.00%±4.62% 、10.0%±5.23%。

2 通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn) 急性心肌梗死患者外周血單個核細(xì)胞NF-κB核染色陽性百分率與TNF-α、IL-1β表達(dá)均呈正相關(guān)（rTNF-α＝0.649，P＜0.01；rIL-1β＝0.535，P＜0.01）（見表2）。

3 通過χ2檢驗發(fā)現(xiàn) 對照組和觀察組的性別和心功能分級（killip分級），及合并癥無顯著性差異。

表1 外周血單個核細(xì)胞NF-kB染色陽性率與血漿細(xì)胞因子測定（%，ng／ml，±s）

表1 外周血單個核細(xì)胞NF-kB染色陽性率與血漿細(xì)胞因子測定（%，ng／ml，±s）

注：在發(fā)病3d，A組與B組方差分析值P＞0.05.；14d的A和B圖方差分析值P＞0.05.

心室重塑組（A組） 心室未重塑組（B組）項 目對照組（C組3d 2周3d 2周NF-KB TNF-a Il-1β）0.11±0.05 26.00±7.60 1.73±0.28 0.56±0.22 20.45±5.46 1.65±0.20 0.44±0.20 22.30+8.22 1.59±0.28 0.48±0.11 13.00±4.62 1.39±0.25 0.14±0.04 10.05±5.23 1.27+0.23

表2 NF-KB 相關(guān)性分析

圖1、2：AMI后未重塑患者；圖3：AMI后重塑患者；圖：外周血PBMCs中NF-kB免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果（10×100倍）

討 論

急性心肌梗死心肌壞死可繼發(fā)的局部和全身的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷和心肌擴(kuò)大及心力衰竭，即不可逆的心室重塑［3］。

NF-κB扮演一個炎癥反應(yīng)和先天免疫的中樞調(diào)節(jié)因子，NF-κB的活性是通過控制細(xì)胞的增殖遷移、細(xì)胞的分化和細(xì)胞的凋亡發(fā)揮作用的。它屬于Rel家族（p50，p52，p65，c-Rel，and RelB），享有保守的Rel同源序列，能形成異源二聚體（p50／p65，p50／p50，或p65／p65），存在于細(xì)胞質(zhì)中。在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中NF-κB是靜止的、無活性的，被IκB抑制。各種刺激包括致炎因子，氧化應(yīng)激，細(xì)菌和病毒產(chǎn)物，或缺氧刺激激活。在NF-κB經(jīng)典的激活通路中，IKK復(fù)合物磷酸化IκB，導(dǎo)致26S蛋白體泛蛋白化和降解，因此暴露NF-κB亞單位上的核定位信號和NF-κB的轉(zhuǎn)錄上調(diào)各種靶基因，參與各種生理和病理過程，包括AMI。AMI發(fā)生后，激活的NF-κB介導(dǎo)了左心室重塑和心功能惡化［4］。事實上，對于NF-κB功能更詳細(xì)功能是不同的亞單位有不同的功能，在這項研究，我們的焦點集中在心梗后NF-κB p50，p50亞單位是通常考慮是NF-κB復(fù)合物的抑制劑［5］，因為p50／p50同源二聚體是一直轉(zhuǎn)錄活性的必需的。

許多研究顯示NF-κB是心肌缺血的炎癥反應(yīng)介質(zhì)，TOLL受體，它的信號傳導(dǎo)通過NF-κB，而TOLL受體在心肌梗死后左室重塑起中樞性的作用［6，7］，通過用IKB酶的磷酸化抑制劑抑制NF-κB的核易位，左室重塑和心力衰竭可以被改善［8］，注射有高親和力雙股誘導(dǎo)DAN的阻斷NF-κB，可以減輕大鼠模型的心肌缺血和再灌注損傷［9］，F(xiàn)rantz等［10］用 ELISA 等方法對心肌梗死后10周鼠的心肌細(xì)胞NF-κB易位情況的研究表明：在心肌梗死后心肌細(xì)胞中NF-KB慢性并持續(xù)的激活。動物實驗表明NF-κB的活化可以促發(fā)并加劇心肌肥厚、心功能惡化［11］。NF-κB能發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)性的作用，在心肌梗死后心室重塑和心力衰竭中也發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［12］。因此阻斷NF-κB活性被認(rèn)為是一個有前景的阻止有害的心梗后左室重塑途徑。

急性心肌梗死后在體內(nèi)的IL-1β表達(dá)是增加的，心肌壞死部位直接產(chǎn)生白介素-1β炎性因子，負(fù)責(zé)內(nèi)皮系統(tǒng)的激活、白細(xì)胞聚集和炎癥反應(yīng)擴(kuò)大化；IL-1β也可導(dǎo)致非心梗的部位心肌損害［13］；并可促進(jìn)心肌纖維化和心肌肥大［14，15］。相應(yīng)地，TNF-a也是增加的，持續(xù)存在的TNF-a導(dǎo)致心肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變和MMPs活性增加，不斷增加的TNF-a，抑制心肌收縮力、誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡和基質(zhì)纖維增生，加劇了心室重塑的進(jìn)程［16］。

本實驗研究表明：正常人PBMC中就有NF-κB的微量表達(dá)，NF-κB染色多位于胞質(zhì)中，核染色較少，已證實適量的NF-κB表達(dá)對人體組織的生長和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要的調(diào)節(jié)作用。AMI患者的外周單個核細(xì)胞的NF-κB表達(dá)在3d明顯高于正常人（見圖），且心室重塑組與未重塑組無差別。這表明，在急性心肌梗死后大量炎癥因子的刺激下，NF-κB與IκB解離，發(fā)生了核移位，促使NF-κB的過度表達(dá)。14d時，AMI后心室重塑組的患者NF-κB顯著高于未重塑患者，兩者比較有統(tǒng)計學(xué)意義，說明NF-κB在AMI后持續(xù)活化激活參與了心室重塑發(fā)生發(fā)展；未重塑組雖已下降，高于正常對照組，但已無統(tǒng)計學(xué)差異；另外，心室重塑組血漿細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的水平較心室未重塑組、對照組顯著升高，并且NF-κB染色的陽性百分率與細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β的水平顯著正相關(guān)，rTNF-α＝0.649，P＜0.01；rIL-1β＝0.535，P＜0.01（見表2）。心室未重塑組14d和對照組，核因子與腫瘤因子、白介素相關(guān)性較心室重塑組低，或無相關(guān)性（見表2）；這說明心室重塑組激活轉(zhuǎn)錄水平的NF-kB可以促進(jìn)靶基因細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β分泌來參與心室重塑及心力衰竭等病理生理過程。

另外本實驗還發(fā)現(xiàn)，58例急性心肌梗死患者，行PCI者35例；發(fā)生左心室構(gòu)（LVRM）的13例，未行冠脈介入術(shù)（PCI）者23例；發(fā)生LVRM的18例；經(jīng)卡方檢驗χ2＝9.431，P＝0.002，P＜0.01。所以兩組重塑發(fā)生率有差別。說明行盡早行PCI、恢復(fù)冠脈重建，有可能減少急性心肌梗死后心室重塑的發(fā)生率。

本實驗采用細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)法，比較直觀，可以清楚觀察NF-κB p50，在胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)分布的情況，操作簡便，可同時對NF-κB進(jìn)行定位和半定量檢測。但若對NF-κB精確地檢測采用Western blont或EMSA法。

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