劉曉強(qiáng) 呂 崢 孫 光 郭宗華 郭戰(zhàn)軍 周曉亮

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科A區(qū)，天津市河西區(qū)平江道23號，300211)

右歸丸是明代名醫(yī)張景岳所創(chuàng)，功效溫補(bǔ)腎陽，填精止遺，中醫(yī)辨證屬腎陽虛精血虧虛者。用現(xiàn)代工藝將其制成膠囊，克服了原蜜丸的諸多缺點(diǎn)。右歸膠囊在治療糖尿病性勃起功能障礙中的作用機(jī)制尚不明確，本研究應(yīng)用糖尿病大鼠勃起功能障礙模型，觀察不同劑量右歸膠囊對DED大鼠勃起功能的影響及大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡及抗氧化指標(biāo)變化，探討右歸膠囊在治療DED中的作用機(jī)制。

1 材料

試藥:右歸膠囊，由江西銀濤藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格:0.45g/粒。動(dòng)物:選用10周齡SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70只，體重(247±26)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院放射醫(yī)學(xué)研究所提供(交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)勃起功能正常);鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma);阿撲嗎啡(apomorphin，APO，Sigma);超氧化物歧化酶試劑盒、GSH試劑盒、GSH-Px試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;單克隆兔抗大鼠Bcl-2抗體、單克隆兔抗大鼠Bax抗體、山羊抗兔二抗顯色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;羅氏血糖儀及試紙等。STZ溶液配制:STZ溶解于0.1mmol/L檸檬酸 -檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.5)中，濃度為20mg/mL，注意避光，現(xiàn)用現(xiàn)配。APO溶液:APO溶解于0.5mg/kg的維生素C與生理鹽水中，調(diào)整體積為5mL/kg。

2 方法

2.1 大鼠糖尿病模型的建立與阿樸嗎啡檢測勃起功能 70只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2天，隨機(jī)選取60只為模型組，稱重后尾靜脈注射STZ溶液60mg/kg;余10只作為正常對照組，尾靜脈注射相應(yīng)劑量0.1mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。造模后96h斷尾采血測定隨機(jī)血糖，血糖＞16.7mmol/L，出現(xiàn)多飲、多尿、多食等糖尿病癥狀判定為造模成功。將造模成功的58只DM大鼠隨機(jī)分為4組，右歸膠囊高劑量組3.6g·kg-1(n=15)、中劑量組 2.4g·kg-1(n=14)、低劑量組 1.2g·kg-1(n=14)、生理鹽水對照組(n=15)，以上各組均每日灌服給藥1次，持續(xù)10周。造模成功12周后，稱重后將大鼠置于透明觀察箱使大鼠適應(yīng)環(huán)境10min，保持室內(nèi)安靜、光線昏暗。大鼠頸項(xiàng)皮下注射阿撲嗎啡100μg/kg，觀察30min，記錄陰莖有無勃起、勃起次數(shù)及勃起潛伏期(從給藥到出現(xiàn)勃起的時(shí)間)。龜頭充血、末端陰莖體出現(xiàn)則認(rèn)為勃起。未勃起的DM大鼠為糖尿病非ED，剔除出組。

2.2 分光光度法檢測 處死動(dòng)物，去除陰莖軟骨、皮膚、尿道海綿體等組織，取部分陰莖海綿體組織，用小剪刀剪碎組織后，置入勻漿管后在冰水中超聲勻漿后，應(yīng)用離心機(jī)3000r/min，離心10min。取上清進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。應(yīng)用比色法測定組織中抗氧化劑GSH、GSH-Px和SOD含量，衡量組織中抗氧化能力。

2.3 免疫組化法檢測 將部分大鼠陰莖組織置入醋酸-乙醇-福爾馬林液中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，石蠟切片，梯度下行脫蠟入水后用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，加入兔抗鼠Bcl-2、Bax抗體，滴加生物素化二抗工作液，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，DAB顯色，梯度上行乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。400倍光鏡下觀察Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)及分布，每張切片至少觀察5個(gè)視野并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，測定每個(gè)視野中表達(dá)Bcl-2、Bax蛋白的陽性細(xì)胞率(陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果用(±s)表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 DM模型建立及APO誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 60只注射STZ的大鼠中58只成模，成模率96.6%。飼養(yǎng)12周后各成模組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿及體重減輕等糖尿病癥狀。成模組大鼠因感染、酮癥酸中毒而死亡8只，病死率為13.7%。灌胃容積為1mL/100g，1日1次，連續(xù)12周，第12周后頸部皮下注射阿撲嗎啡100μg/kg，觀察30min內(nèi)各組大鼠勃起情況，并記錄勃起潛伏期，即從給藥開始到出現(xiàn)陰莖勃起的時(shí)間。陰莖勃起陽性率為每組中有陰莖勃起的大鼠的百分比。如表1，注射STZ 12周后，按APO誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)未出現(xiàn)勃起者為ED的標(biāo)準(zhǔn)，高、中、低劑量組及DM組成DM性ED模型分別為10、12、12、10只，成糖尿病非勃起功能障礙模型剔除出組。正常對照組大鼠的陰莖勃起次數(shù)、勃起陽性率及勃起潛伏期與其余各組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余各劑量組之間陰莖勃起次數(shù)、勃起陽性率及勃起潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 對DM大鼠勃起功能的影響(±s)

表1 對DM大鼠勃起功能的影響(±s)

注:正常對照組勃起次數(shù)與其他各組組相比，＊＊P＜0.01。

分組 例數(shù) 陰莖勃起陽性率(%)陰莖勃起次數(shù)勃起潛伏期(min)DM+高劑量組13 9.1 1 11 ±1 DM+中劑量組 13 8.1 1 13 DM+低劑量組 13 7.6 1 12 DM 組 11 9.1 1 15正常對照組 10 100 2.3 ±0.5＊＊5±2

3.2 各組大鼠陰莖海綿體組織 GSH含量及SOD、GSH-Px活性結(jié)果 表2表明，DM組大鼠與正常對照組相比，陰莖海綿體組織中GSH含量明顯降低，SOD、GSH-Px活性明顯降低;DM+右歸膠囊高劑量組與DM組相比，GSH含量增加，SOD、GSH-Px活性提高(P＜0.05)。而右歸膠囊中、低劑量組與糖尿病組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 大鼠陰莖海綿體組織中GSH含量及抗氧化物酶SOD、GSH-Px活性(±s)

表2 大鼠陰莖海綿體組織中GSH含量及抗氧化物酶SOD、GSH-Px活性(±s)

注:與正常對照組相比，＊＊P＜0.01;DM+高劑量組與DM組相比，*P＜0.05。

分組 數(shù)目 SOD(ng/mL)GSH(mgGSH/gprot)GSH-Px(U/mL)DM+高劑量組 10 282.12 ±18.24* 1.47 ±0.71* 172.34 ±12.48*10 332.71 ±29.23 2.13 ±0.35 198.21 ±9.23 DM+中劑量組 12 233.76 ±14.28 1.01 ±0.46 148.67 ±13.51 DM+低劑量組 12 245.69 ±14.12 1.11 ±0.23 133.95 ±14.73 DM 組 10 211.45 ±15.29＊＊ 0.81 ±0.21＊＊ 128.73 ±10.12＊＊正常對照組

表3 大鼠陰莖海綿體組織凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)(±s，%)

表3 大鼠陰莖海綿體組織凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)(±s，%)

注:DM組與正常對照組相比，＊＊P＜0.01;DM+高劑量組與DM組相比，*P ＜0.05。

Bcl-2/Bax組別 數(shù)目 Bcl-2表達(dá) Bax表達(dá)DM+高劑量組 10 16.78 ±4.23*10 24.56 ±2.34 12.11 ±1.34 2.01 16.62 ±2.34 1.01 DM+ 中劑量組 12 11.19 ±2.13 19.12 ±2.11 0.58 DM+ 低劑量組 12 12.06 ±2.61 18.45 ±3.81 0.65 DM 組 10 9.31 ±3.04＊＊ 20.23 ±2.11＊＊ 0.46正常對照組

3.3 大鼠陰莖海綿體組織凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá) 染色結(jié)果顯示，Bax、Bcl-2蛋白主要表達(dá)于陰莖海綿體血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的胞漿中，多以棕色、深棕色著色為主。正常對照組與其余各組相比，Bcl-2細(xì)胞陽性率高、Bax細(xì)胞陽性率低，Bcl-2/Bax比值較高;DM+右歸膠囊高劑量組與DM組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。

4 討論

右歸膠囊是對原右歸丸在不改變其處方組成的基礎(chǔ)上，將蜜丸改為膠囊劑。附子、肉桂溫腎陽，暖下元;鹿角膠、杜仲、菟絲子補(bǔ)腎陽，益精血;熟地黃、山藥、山茱萸、當(dāng)歸、枸杞子滋腎陰，養(yǎng)肝血。諸藥配伍，陽得陰助，體現(xiàn)“陰中求陽”法則。右歸膠囊中多種成分具有抗氧化應(yīng)激的作用，如熟地黃對慢性應(yīng)激性小鼠具有良好的抗氧化作用，并能有效的緩解慢性應(yīng)激引起的丙二醛含量升高、超氧化物歧化酶活性下降等［1］。臨床研究表明［2］，右歸膠囊對于改善患者遺精、性功能減退有較好的改善臨床癥狀的作用。

糖尿病是引起勃起功能障礙的常見原因，糖尿病患者ED患病率為25% ～75%，多在50%左右。雖然PDE5抑制劑等可有效改善部分患者的癥狀，但是仍有部分患者不能從中受益。因而對與糖尿病性ED的發(fā)病機(jī)制及有效治療有待于進(jìn)一步的研究［2］。近年來研究表明，糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激有關(guān)。糖尿病時(shí)血液中高濃度的葡萄糖可通過活性氧引起氧化損傷破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙［3］。氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)高活性分子如活性氧簇(ROS)產(chǎn)生過多或消除過少，引起組織損傷。生理情況下雖然有活性氧的產(chǎn)生，并不造成機(jī)體的氧化損傷，這主要是由于機(jī)體存在抗氧化防御系統(tǒng)，包括抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶等)和抗氧化劑(如谷胱甘肽、維生素E、類胡蘿卜素、輔酶Q及維生素C等)使機(jī)體處于氧化抗氧化的平衡狀態(tài)［4-5］。在病理狀態(tài)下活性氧產(chǎn)生增多、抗氧化酶和抗氧化劑合成減少活性降低，機(jī)體處于過氧化狀態(tài)，即可造成機(jī)體的氧化損傷。糖尿病性ED大鼠海綿體組織中的抗氧化酶SOD、GSH-Px含量下降，GSH含量明顯減少，因此推斷右歸膠囊對DM性大鼠ED的保護(hù)，可能是通過增強(qiáng)SOD、GSH-Px的活性，增加GSH含量，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)的能力，從而抑制機(jī)體內(nèi)活性氧對組織的損傷。右歸膠囊可以提高機(jī)體抗氧化能力，從而改善并延緩DM大鼠ED的氧化應(yīng)激損傷。

糖尿病時(shí)由于產(chǎn)生較多活性氧與NO相互作用，形成促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子，引起陰莖海綿體細(xì)胞凋亡［6］。機(jī)體處于過氧化狀態(tài)可能是誘發(fā)凋亡的關(guān)鍵原因。陰莖細(xì)胞凋亡是引起勃起功能障礙的一個(gè)原因［7］。陰莖海綿體細(xì)胞凋亡是Bcl-2與Bax共同參與調(diào)節(jié)［8］。Bcl-2和Bax基因是與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的凋亡基因，Bcl-2是凋亡抑制基因，編碼產(chǎn)生Bcl-2蛋白，Bax是促調(diào)亡基因，編碼產(chǎn)生Bax蛋白。Bax可在細(xì)胞中自我形成同源二聚體或與Bcl-2形成異源二聚體。Bax-Bax促使細(xì)胞凋亡，而Bax-Bcl-2異源二聚體可以抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生［9］，比例上調(diào)時(shí)，抑制細(xì)胞凋亡;比例下調(diào)時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。糖尿病大鼠勃起功能障礙的機(jī)制之一可能是陰莖海綿體細(xì)胞凋亡，平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，平滑肌數(shù)目減少及結(jié)構(gòu)損害，直接影響平滑肌舒張功能，海綿竇舒張受限，動(dòng)脈充盈受阻。其具體機(jī)制可能是糖尿病時(shí)，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，激活鈣離子依賴性激酶或磷酸酶，誘導(dǎo)凋亡基因的表達(dá);亦可激活蛋白酶與核酸內(nèi)切酶，促進(jìn)DNA的損傷;糖尿病時(shí)有多發(fā)神經(jīng)病變，推測海綿體神經(jīng)受損與細(xì)胞凋亡有關(guān)。右歸膠囊高劑量組糖尿病ED大鼠與糖尿病ED組大鼠相比，Bcl-2蛋白表達(dá)增多，Bax蛋白表達(dá)減少，Bcl-2/Bax比值較高，均提示右歸膠囊可以增加組織抗凋亡的能力，其抗凋亡能力是通過改善組織氧化應(yīng)激損傷實(shí)現(xiàn)的。但并未發(fā)現(xiàn)各組大鼠之間勃起陽性率之間的差異，推測可能的原因由于樣本量小、給藥時(shí)間較短造成，因此需要進(jìn)一步深入研究。

［1］張迪.熟地黃及其不同部位的抗氧化作用研究［D］.山東大學(xué)，2009.

［2］薛維信.右歸膠囊治療遺精臨床療效觀察［J］.江西中醫(yī)藥，2001，32(6):17.

［3］饒可，劉繼紅.氧化應(yīng)激與男性勃起功能障礙［J］.中國男科學(xué)雜志，2009，23(3):66-68.

［4］Zab?ocka A，Janusz M.The two faces of reactive oxygen species［J］.Postepy Hig Med Dosw(Online)，2008，26(62):118-24.

［5］Poyton RO，Ball KA，Castello PR，et al.Mitochondrial generation of free radicals and hypoxic signaling［J］.Trends Endocrinol Metab，2009 Sep，20(7):332-40.

［6］劉劍新，夏仁惠，傅梧，等.糖尿病大鼠陰莖細(xì)胞凋亡及血流動(dòng)力學(xué)變化的研究［J］.中華男科學(xué)雜志，2004，10(6):445-448.

［7］Walsh PC，Retik AB ，Vaughan ED，et al.Campbell’s Urology M.7th ed.Philadelphia:WB Saunders Company，1998:1381-1452.

［8］王德明，謝紅，王國政.糖尿病大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡與Bcl-2和Bax基因表達(dá)［J］.中華男科學(xué)雜志，2004，10(11):844-848.

［9］Yin XM，Oltvai ZN，Korsmeyer SJ，et al.BH1 and BH2 domainsof Bcl 2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with Bax［J］.Nature，1994，369(6478):321-323.