左 玲 貝鵬劍 胡國(guó)華

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院婦科，上海市閘北區(qū)芷江中路274號(hào)，200071)

解脲脲原體是泌尿生殖道感染的常見病原體之一，它不僅引起NGU，還可導(dǎo)致盆腔炎、不孕癥、自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、妊娠期感染、新生兒感染等疾病。近年來(lái)，在臨床上中藥治療支原體的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到重視。胡國(guó)華教授進(jìn)行中草藥體外抗Uu的藥敏研究，發(fā)現(xiàn)清熱解毒類的中藥具有較好的抗支原體作用［1－2］，盆炎湯是名老中醫(yī)朱南孫教授治療慢性盆腔炎的經(jīng)驗(yàn)方，臨床上療效確切?，F(xiàn)將2009年9月至2010年3月于上海市中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室所做的動(dòng)物試驗(yàn)——盆炎湯治療Uu感染小鼠生殖系統(tǒng)的療效報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性昆明種小鼠，體重(30±2)g，清潔級(jí)，8～10周，共63只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。63只小鼠隨機(jī)分為7組，每組9只。1)正常組:注射雌激素，不接種Uu菌液;2)模型組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液;3)西藥組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液;4)中西藥結(jié)合組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液;5)盆炎湯大劑量組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液;6)盆炎湯中劑量組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液;7)盆炎湯小劑量組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液。

1.2 試劑及藥品 Uu液體無(wú)菌培養(yǎng)液、Uu固體無(wú)菌培養(yǎng)基(以上均由上海恩康生物科技有限公司提供)，血清8型Uu菌株(購(gòu)于美國(guó)菌種收藏中心，復(fù)蘇傳代)，阿奇霉素片(規(guī)格:0.25g/片，湖北廣濟(jì)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20090201)(參照2006年美國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病治療指南專輯)，苯甲酸雌二醇(規(guī)格:2mg/mL，上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):070402)，中藥盆炎湯組成:蒲公英30g，紅藤30g，延胡索15g，劉寄奴12g，續(xù)斷12g。煎煮濃縮后計(jì)算得所濃縮的最大濃度約為4.5g/mL。(上海市中醫(yī)醫(yī)院提供)。

1.3 方法

1.3.1 造模 參照文獻(xiàn)造模［3－4］:1)所有小鼠頸部皮下均注射苯甲酸雌二醇0.4mg/只，每周1次，共4次;2)所有小鼠注射雌激素1周后，除正常組外，其余小鼠均感染Uu。用微量移液器吸取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Uu菌液50μL，伸入小鼠陰道約0.5cm，將Uu菌液緩緩注入小鼠陰道內(nèi)，注入完畢后將小鼠倒置半分鐘，使Uu菌液能充分與生殖道內(nèi)壁接觸。1周后取小鼠陰道分泌物進(jìn)行培養(yǎng)，顯微鏡下觀察到Uu菌落表明造模成功。

1.3.2 藥物治療 造模成功后開始用藥。1)正常組:無(wú)菌純凈水灌胃0.5mL/次×14d;2)模型組:無(wú)菌純凈水灌胃0.5mL/次×14d;3)西藥組:阿齊霉素0.21g/kg，灌胃、頓服;4)中西藥結(jié)合組:阿齊霉素0.21g/kg，頓服;盆炎湯小劑量灌胃×13d;5)盆炎湯大、中、小劑量組:分別用4.5g/mL、2.25g/mL、1.13g/mL的中藥湯劑灌胃0.5mL/次×14d。

1.3.3 觀察 實(shí)驗(yàn)過程中觀察小鼠的飲食、飲水情況，體重變化，毛色變化，生殖道分泌物及大小便情況。

1.3.4 白介素檢測(cè) 處死小鼠前采用股動(dòng)脈取血法，將所取血液及時(shí)離心后取上清液，采用雙抗體夾心ABC－ELISA法檢測(cè)小鼠血清中白介素－1β、白介素－6的濃度。

1.3.5 凋亡 實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死各組小鼠，剖腹，肉眼觀察小鼠陰道分泌物、子宮等腹腔內(nèi)情況。取部分陰道、子宮組織，用10%甲醛固定，做病理HE染色，切片。用TUNEL法檢測(cè)小鼠陰道、子宮組織凋亡細(xì)胞數(shù)量。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS18.0軟件完成，采用方差分析方法(剔除偏差太大的數(shù)值，檢測(cè)方差齊)。

2 結(jié)果

2.1 觀察結(jié)果 接種Uu菌液后第2～3周小鼠的飲水量明顯增加，陰道周圍紅腫，分泌物增多，個(gè)別小鼠生殖道周圍有脫毛伴液體滲出現(xiàn)象。小鼠的尿液氣味臭穢，尿量增多，色黃。處死小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)部分小鼠有子宮增粗、水腫，子宮壁變薄，剪開子宮組織可見有腔內(nèi)有透明液體流出，部分小鼠有子宮變硬的現(xiàn)象。也可見小鼠膀胱內(nèi)膿性分泌物，膀胱壁變厚，甚則壞死。

2.2 白介素－1β及白介素－6比較結(jié)果 經(jīng)F檢驗(yàn)，白介素－1β模型組、西藥組及中藥小劑量組與正常組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，從均值可以看出，中西藥結(jié)合組、中藥大、中劑量組的白介素－1β較其他組有降低的趨勢(shì);白介素－6各干預(yù)組存在較模型組降低的趨勢(shì)，其中中藥大劑量組的降低最為明顯，見表1。

表1 白介素－1β及白介素－6比較(±s)

表1 白介素－1β及白介素－6比較(±s)

注:模型組、西藥組、中藥小劑量組與正常組比較，*P＜0.05。

組別 例數(shù) IL－1β(pg/mL) IL－6(pg/mL)8 29.37±16.41 29.38±19.51模型組 8 45.47±11.72* 30.22±11.05西藥組 9 47.60±20.27* 26.29±9.21中西藥組 9 36.65±10.33 24.15±7.08中藥大劑量 9 39.43±13.73 27.89±8.69中藥中劑量 8 34.0±9.93 26.78±8.20中藥小劑量 9 47.10±16.68*正常組27.67±6.97

2.3 各組小鼠子宮組織及陰道組織凋亡比較結(jié)果從均值可以看出子宮組織細(xì)胞凋亡率干預(yù)各組存在較模型組降低的趨勢(shì)，尤以西藥組、中西藥組、中藥大劑量組為明顯。與模型組相比較各組陰道組織細(xì)胞凋亡率均有明顯降低的趨勢(shì)，且以中藥大劑量組最為明顯。見表2。

表2 各組小鼠子宮組織及陰道組織凋亡比較(±s)

表2 各組小鼠子宮組織及陰道組織凋亡比較(±s)

注:正常組、中西藥組、中藥大劑量組與模型組比較，＊＊P＜0.01;西藥組、中藥中小劑量組與模型組比較，*P＜0.05。

組別 例數(shù) 子宮組織 陰道組織正常組 8 7.11±2.80 5.74±2.80＊＊模型組 8 7.38±3.03 9.88±3.00西藥組 9 6.41±1.97 7.53±1.91*中西藥組 9 5.31±0.94 6.89±2.57＊＊中藥大劑量 9 5.46±1.86 5.93±1.59＊＊中藥中劑量 8 6.91±2.41 7.01±1.20*中藥小劑量 9 5.96±1.22 7.26±2.39*

3 討論

細(xì)胞凋亡是1972年首先由英國(guó)科學(xué)家Kerr提出的，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，但是細(xì)胞凋亡過多將導(dǎo)致組織損傷和功能紊亂。支原體細(xì)胞膜中含有豐富的脂蛋白，稱為脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白，有學(xué)者認(rèn)為支原體的致病性可能與該膜蛋白有關(guān)。支原體LAMPs主要通過直接致病作用和免疫損傷等機(jī)制參與宿主細(xì)胞的損傷和凋亡［5］，LAMPs能影響淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞膜的通透性，從而誘導(dǎo)這些細(xì)胞釋放ATP，后者能與免疫細(xì)胞膜上的P2嘌呤受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死［6］。LAMPs具有很強(qiáng)的抗原性，并能以較高的頻率發(fā)生相變異。它可以刺激人單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌腫瘤壞死因子－a、白介素－1β、白介素－6，而腫瘤壞死因子－a、白介素－1β等都是前炎癥的細(xì)胞因子，是啟動(dòng)急性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞因子，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切［7－10］。本實(shí)驗(yàn)中觀察到Uu感染小鼠不同程度的出現(xiàn)膀胱病變、子宮組織水腫等，及白介素－1β濃度模型組、西藥組及中藥小劑量組與正常組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明Uu感染后可以上行感染，刺激炎癥反應(yīng)。張迅［11］等研究表明Uu可致生殖細(xì)胞凋亡增加，陰道組織細(xì)胞凋亡各組與模型組相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中正常組、中西藥組、中藥大劑量組與模型組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，西藥組、中藥中、小劑量組與模型組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);說明Uu感染后陰道組織細(xì)胞凋亡增加，用藥后可以減少炎癥反應(yīng)，從而抑制細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，其中以中西藥結(jié)合及中藥大劑量對(duì)陰道組織細(xì)胞的凋亡抑制作用最為顯著;西藥、中藥中、小劑量對(duì)陰道組織細(xì)胞的凋亡也有抑制作用。均值提示子宮組織細(xì)胞凋亡干預(yù)各組存在較模型組降低的趨勢(shì)，尤以西藥組、中西藥組、中藥大劑量組為明顯;陰道組織細(xì)胞凋亡各組與模型組相比較均有明顯降低的趨勢(shì)，中藥大劑量組降低最為明顯。

綜上，盆炎湯可以抑制白介素－1β及白介素－6的產(chǎn)生，從而減輕支原感染炎癥反應(yīng)所造成的病理?yè)p傷，降低支原體感染所造成的生殖細(xì)胞凋亡，并且這種作用隨著用藥劑量的增加而增強(qiáng)。

［1］Taylor－ robinson D.，F(xiàn)urr P.M..Observations on experimental colonisation of mice by ureaplasmas of human origin［J］.Med Microbiol，2002，51:866－870.

［2］潘展硯，黃欣，黃崢燁，等.解脲脲原體陰道炎動(dòng)物模型建立及強(qiáng)力霉素治療療效觀察［J］.中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2007，21(12):741－743.

［3］胡國(guó)華，葉元康，夏英，等.抗溶脲脲原體的中草藥篩選的實(shí)驗(yàn)研究［J］.天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，17(3):43 －45.

［4］左玲，胡國(guó)華.中藥對(duì)乳酸桿菌與解脲脲原體臨床分離株的體外抑制實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(12):2999 －3000.

［5］何軍，吳移謀.支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24(11):1074 －1076.

［6］Into T，Okada K，Inoue N，et al.Extracellular ATP regulates cell death of lymphocytes and monocytes induced by membrane－bound lipoproteins of Mycoplasma fermentans and Mycoplasma salivarium［J］.Microbiol Immunol，2002，46(10):667 － 675.

［7］Mühlradt，P.F.，F(xiàn)risch，M.Purification and partial biochemical characterization of a Mycoplasma fermentans－derived substance that activates macrophages to release nitric oxide，tumor necrosis factor，and interleukin－6［J］.Infect Immun，1994，62(9):3801 －3807.

［8］曾焱華，吳移謀，鄧仲良，等.穿透支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子［J］.中華傳染病雜志，2006，24(4):251－253.

［9］Bijangi－ Vishehsaraei K，Saadatzadeh M.R，Werne A，et al.Enhanced TNF－α–induced apoptosis in Fanconi anemia type C–deficient cells is dependent on apoptosis signal－ regulating kinase 1［J］.Blood，2005，106(13):4124－4130.

［10］魯杰，趙小元，孫寶嶺，等.肺炎支原體對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞激活作用的研究［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22(5):477 －478.

［11］張迅，何清湖，劉朝圣.知柏地黃湯對(duì)解脲脲原體感染大鼠動(dòng)物模型生殖細(xì)胞凋亡及Fas、FasL表達(dá)的影響［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，25(1):9 －11.