張遠冬 張有金 郭延壘 劉學慶 于超

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)亦稱血清素(Serotonin)，是人體內重要的神經遞質，其參與睡眠、攝食、體溫、學習、記憶等多種生理過程［1］。中樞神經系統(tǒng)5-HT含量異常與重性抑郁障礙(major depressive disorder，MDD)和自殺行為有著極其重要的聯系［2，3］，同時也可以影響血腦屏障通透性的改變［4］。因此定量測定5-HT在腦組織中的含量對精神情感性疾病、腦血管疾病等的發(fā)病機制的研究具有重要參考價值。

據有關文獻報道，5-HT含量測定的方法有生物法、免疫法［5，6］、熒光分光光度法［7］、高效液相-電化學色譜法(HPLCECD)、高效液相-熒光色譜法(HPLC-FLD)、高效液相-紫外色譜法(HPLC-UV)等［8］。目前，在大多數實驗研究中都采用準確、高效、簡便快速的液相色譜法，其中，HPLC-UV法以其儀器成本較低、操作簡單、維護簡便，因而在實驗室中應用較為廣泛，使用頻率大大高于HPLC-ECD和HPLC-FLD。此外，HPLC-UV法常用于血清中5-HT含量的測定，但對于大鼠腦組織中5-HT含量的測定鮮有報道，因此本實驗采用HPLC-UV法，建立了快速穩(wěn)定、準確可靠的測定大鼠腦組織中5-HT含量的方法，為5-HT等相關神經遞質類疾病的臨床研究提供重要參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(SHIMADZU LC-2010AHT);Z233MK型高速冷凍離心機(德國HEMNLE公司);3240025組織勻漿機(德國IKA公司);XS-105十萬分之一精密電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);SB-3200DT超聲波清洗機(寧波新芝公司);SEVEN Multi PH計(瑞士METTLER TOLEDO公司);Elix10超純水凈化系統(tǒng)(美國MILLIPOER公司);01730微孔過濾器(美國MILLIPORE公司)。

鹽酸-5-羥色胺(Serotonin hydrochloride，美國 SIGMAALORICH公司，批號:H9523-25MG);甲醇為色譜純(美國TEDIA公司)，水為超純水，其他試劑均為市售分析純。

1.2 色譜條件 色譜柱為SHIMADZU VP-ODS C18柱(250×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.01 mol/L的醋酸鉀緩沖液(10:90，V/V，用0.2 mol/L檸檬酸調pH至4.00)等度洗脫，柱溫:25℃，流速:1.00 ml/min，檢測波長:275 nm。

1.3 標準品溶液的配制 精密稱取5-HT標準品1.480 mg于容量瓶中，加超純水溶解并定容，制成1 mg/ml的標準品貯備液，避光，-20℃冷藏保存。按實際檢測需要稀釋到相應的濃度，供檢測用。

1.4 樣品來源及制備 清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠5只，每只平均體重為200±20 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物質量合格許可證號為SCXK(渝):2007-0002。

大鼠斷頭處死后取整個腦組織，稱濕重，以1∶15加入PBS(1 mol/L磷酸氫二鉀:1 mol/L磷酸二氫鉀=80:20混合)，于冰浴中充分勻漿后混勻。為選擇合適的蛋白沉淀劑，將勻漿液分為三份，分別加入勻漿液體積一半量的乙腈、10%三氯乙酸、10%高氯酸沉淀蛋白。充分渦旋后，在4℃下以12000 rpm離心15 min后精密吸取上清液200 μl，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至7.0，過0.45 μm濾膜后于 -80℃保存待測

2 結果

2.1 專屬性考察 為確定流動相的最適pH值，分別考察了醋酸鉀緩沖液pH值在5.00、4.50、4.00時的色譜峰峰形及峰高，結果如圖1所示，pH在5.00和4.50時，峰形較寬，且有嚴重拖尾，當pH為4.00時，峰型良好，拖尾得到了良好的改善，因此確定緩沖液pH為4.00，與甲醇比例為90:10(V/V)進行等度洗脫，結果如圖2所示，5-HT峰形良好，且無內源性物質干擾，其保留時間為9.3 min。

2.2 線性范圍與最低檢測限 精密量取5-HT標準品儲存液各20 μl，分別加入超純水稀釋，配成濃度為 0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/ml的標準溶液。在此色譜條件下進樣測定，以面積A為縱坐標(Y)，以濃度C(X)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為 A =46008.89C +1886.58(r=0.9999)，表明5-HT 在0.1 ～20 μg/ml范圍內線性關系良好，適合于5-HT含量的測定;5-HT的最低檢測限(LOD)為40 ng/ml(S/N＞3)。

2.3 精密度實驗 精密吸取5-HT標準品溶液各20 μl，分別加超純水稀釋，制成高、中、低三種濃度為7.5、1.5、0.15 μg/ml的標準溶液200 μl，于第1 d各測定5次，每次進樣20 μl，計算當日內峰面積的相對標準偏差(RSD)，考察日內精密度;同時連續(xù)測定3 d，計算3 d內峰面積RSD，考察日間精密度。結果如表1所示，各濃度的日內、日間RSD均小于3%;表明此實驗方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察 精密量取5-HT標準品溶液各20 μl，制成高、中、低3 種濃度為7.5、1.5、0.15 μg/ml的標準溶液800 μl，平行制備兩組，一組置于室溫保存，另一組置于-20℃保存，并于第1、2、3、5、7天連續(xù)進樣，每日各測定5 次，記錄峰面積，帶入標準曲線求得測定濃度，計算一周內所測濃度的RSD，考察5-HT的穩(wěn)定性。結果如表2及表3所示，室溫和凍融實驗下5-HT各濃度RSD均小于3%;說明5-HT在室溫和凍融試驗中均較穩(wěn)定，易于保存。

2.5 加樣回收率考察 精密吸取未經蛋白沉淀處理的大鼠腦組織勻漿液3份，再精密加入特定體積的標準品溶液，制成含標準品濃度分別為0.19、0.16、0.13 μg/ml的待測液溶液各200 μl，每一濃度平行制備3組，每組重復測定5次，考察其加樣回收率。按公式:回收率=(測定液測定值-原樣液含測值)/加入量值×100%，計算大鼠腦組織中5-HT加樣回收率。結果如表4所示，所測得范圍為89.62% ～101.6%，符合生物樣品測定要求，說明此色譜條件下所測得的5-HT含量準確度較好。

圖1 不同pH值下的5-HT色譜圖

圖2 5-HT色譜圖

表1 日內、日間精密度考察結果(n=5)

表2 室溫穩(wěn)定性(n=5)

表3 凍融穩(wěn)定性(n=5)

表4 5-HT加樣回收率(n=5)

2.6 樣品含量的測定 取大鼠腦組織樣品，按“1.4”項下方法操作，平行制備3組，并在此色譜條件下進行測定，照外標法計算，測得該組織樣品中5-HT含量為(0.2715±28)μg/g。

3 討論

在以往研究中，5-HT的含量測定方法眾多，其中，免疫法實驗條件要求高;熒光分光光度法操作復雜，數據讀取時誤差大，故其應用均受到較大限制;HPLC-ECD、HPLC-FLD、HPLC-UV法現已是國內外測定5-HT較為常用的方法。前二者雖然靈敏度高，但HPLC-ECD法測定時，儀器系統(tǒng)在分析前對樣品進行鈍化要求高［9］，電化學工作電極容易受污染且其樣品極易受其他物質干擾，需嚴格控制測定過程來減少干擾［10］;同時其流動相組成常含有高濃度離子對試劑，對柱子傷害較大。而在HPLC-FLD法中，同樣由于檢測器成本昂貴，大大限制了其使用。本實驗采用HPLC-UV法，建立了穩(wěn)定快速的大鼠腦組織中5-HT的含量測定方法，測定結果準確可靠，適用于臨床和科研對5-HT大樣本量的檢測。

本實驗在參考文獻［11］的基礎上，對檢測方法進行了流動相比例、pH值、離子強度等的優(yōu)化。結果發(fā)現5-HT色譜峰在流動相為4.00時峰形良好，且無內源性物質的干擾;在流動相的配制上，選用10 mmol/L的醋酸鉀溶液，并以0.20 mol/L的檸檬酸調節(jié)pH至4.00的方法，降低了緩沖鹽離子強度，減小了緩沖鹽體系對柱子的損傷程度。

在樣品制備過程中，本文進行了蛋白沉淀試劑的優(yōu)化，比較了乙腈、10%三氯乙酸、10%高氯酸的蛋白沉淀效果。發(fā)現乙腈和10%的三氟乙酸沉淀蛋白時均出現嚴重的干擾峰，而10%的高氯酸沉淀時無蛋白峰干擾，且5-HT色譜峰峰形良好。由于高氯酸有很強的氧化性，對柱子損害較大，因此進樣前需調節(jié)樣品溶液pH值至7.0左右，以降低其對分析柱的損傷。

［1］林凌云，李慧，許崇濤，等.HPLC-熒光法測定大鼠腦組織中的單胺類神經遞制質及相關物質.華西藥學雜志，2007，22(5):557-558.

［2］Rodrigo A，Espana，Thomas E，et al.Sleep Neurobiology from a Clinical Perspective.SLEEP，2011，34(7):845-858.

［3］Neves FS，Malloy-Diniz LF，Romano-Silva MA，et al.Is the serotonin transporter polymorphism(5-HTTLPR)a potential marker for suicidal behavior in bipolar disorder patients.J Affect Disorders，2010，125(1-3):98-102.

［4］Kemaldo P，de Vries Elisabeth GE，Muskiet FA，et al.Clinical chemistry of serotonin and metabolites.J Chromatogr B:Biomed Sci Appl，2000，747(1-2):33-48.

［5］黃建國，陸世華，王曉春.酶免試驗法測定全血5-羥色胺.臨夏醫(yī)學雜志，2002，24(9):545-546.

［6］李建剛，張巧俊，高敬龍，等.腦卒中后抑郁患者5-羥色胺含量的研究.中國臨床神經科學，2007，15(2):129-132.

［7］張秀明，顧仁俊，張中興，等.熒光分光光度法測定血清5-羥色胺的實驗研究及臨床應用.陜西醫(yī)學檢驗，2009，9(1):14-16.

［8］魯燕俠，崔佳藺，興謠，等.RP-HPLC-熒光檢測法測定小鼠腦組織中5種神經遞質的含量.解放軍藥學學報，2003，19(4):262.

［9］譚炳炎，鄭琳，馮翔.高效液相色譜/電化學法測定大鼠血液和腦組織中單胺類物質的含量.分析測試學報，2006，25(2):90-92.

［10］張向暉，劉軍，蘇林雁.庫侖陣列電化學高效液相色譜法測定大鼠腦組織中單胺類神經遞質及代謝產物.醫(yī)學臨床研究，2007，24(1):1-3.

［11］Brazelll MP，Marsden CA，Nisbet AP，et al.The 5-HT 1 receptor agonist RU-24969 decreases 5-hydroxytryptamine(5-HT)release and metabolism in the rat frontal cortex in vitro and in vivo.Br J Pharmacol，1985，86(1):209-216.