鞠振煜，張明威，曲日初，朱寶平，張 偉，田曉豐

（吉林大學(xué)普通外科疾病診療中心、吉林大學(xué)第二醫(yī)院普通外科，吉林 長春130041）

20世紀(jì)80年代減肥醫(yī)師發(fā)現(xiàn)用于減重手術(shù)的胃旁路手術(shù)（Gastric bypass，GBP）可以使伴Ⅱ型糖尿病的肥胖患者在減重的同時，可以使糖尿病癥狀完全緩解。近年來，胃腸道重建的GBP手術(shù)治療2型糖尿病的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在建立自發(fā)性2型糖尿病大鼠GBP手術(shù)模型，探索GBP術(shù)對胰島β細(xì)胞凋亡的影響，為GBP術(shù)治療非肥胖2型糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和動物分組

實(shí)驗(yàn)用8周齡GK大鼠由中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。動物自由攝取凈水，食物為添加高蛋白的含油脂飼料。大鼠在適應(yīng)環(huán)境后，測量體重、空腹、餐后血糖，胰島素。72只大鼠隨機(jī)分為4組：手術(shù)組（O組）、假手術(shù)組（S組）、飲食控制組（F組）和對照組（C組）。原裝進(jìn)口凋亡檢測試劑盒購于美國Promega公司。強(qiáng)生穩(wěn)步血糖測定儀。

1.2 模型制作

O組術(shù)前將大鼠禁食12h，將每只大鼠按照50 mg／kg腹腔內(nèi)注射濃度為0.5%的戊巴比妥鈉，待麻藥生效后，與上腹正中作長約4cm的切口，切斷幽門，縫合十二指腸殘端，在距treitz韌帶約10cm處切斷空腸，幽門斷端與遠(yuǎn)端空腸行端端吻合，在距離胃腸吻合口約12cm處行空腸端側(cè)吻合，均采用0／7號無創(chuàng)傷棉綸線間斷縫合，縫合系膜裂孔。術(shù)中保留了胃的原容積，平均手術(shù)時間為1h。S組：用上述同樣方法對大鼠進(jìn)行麻醉，采取離斷胃竇十二指腸后再原位吻合，并保證相同的麻醉時間。術(shù)終均用慶大霉素（96萬U）2ml沖洗腹腔后關(guān)腹，術(shù)后麻醉醒后自由進(jìn)水，24h后自由進(jìn)食。F組，控制每只大鼠進(jìn)食量15g／d，保證充足飲水。O、F、C組均自由進(jìn)食，保證充足飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

術(shù)前、術(shù)后第1、2、4、8周5個時間點(diǎn)，大鼠禁食過夜，剪尾法取血0.5ml后，灌服葡萄糖（2.5g／kg），30min后再取血0.7ml，血樣分別立即加入裝有DPPIV inhibitor10μL的試管中，混勻，靜置30 min后4 000rpm離心10min，分離血清，用于測定血糖、胰島素。術(shù)后2w、4w、8w測餐后血糖取血后，分批隨機(jī)處死大鼠，每批每組處死6只，大鼠處死后分離胰腺并取出。濾紙吸干水份后沿胰腺縱軸切開，一部分置于10%多聚甲醛中固定待用。血糖測定：取血后使用強(qiáng)生穩(wěn)步血糖儀測定血糖。胰島素測定：采用放射免疫法測定，雙管法，取兩次測定的平均值。TUNEL法檢測胰島β細(xì)胞凋亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同組之間的同一時間點(diǎn)指標(biāo)采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，單個指標(biāo)手術(shù)前后的變化采用配對t檢驗(yàn)，采用SPSS13.0for Windows統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 血糖

O組GΒP術(shù)后第1周空腹血糖已開始下降，術(shù)后第4周空腹血糖由術(shù)前的16.21±0.76mmol／L下降到9.18±0.61mmol／L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；至術(shù)后第8周血糖維持在9.65±0.66 mmol／L，與術(shù)前、術(shù)后2周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。術(shù)后第4周餐后血糖由術(shù)前的31.06±1.10mmol／L下降到13.11±0.71mmol／L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；至術(shù)后第8周下降到12.32±0.66mmol／L，與術(shù)前、術(shù)后2周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；O組術(shù)后第4、8周空腹、餐后血糖與同時間其他各組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；F組在控制飲食1周后空腹血糖也出現(xiàn)下降，第4周、第8周由15.84±114mmol／L 分別下降到11.65±0.63mmol／L、12.00±0.58mmol／L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；S組、C組實(shí)驗(yàn)過程中后空腹血糖無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

2.2 胰島素

O組術(shù)后第4周起空腹血清胰島素水平由術(shù)前27.95±1.16mIU／L升高到62.82±1.87mIU／L，術(shù)后第8周為61.64±1.35mIU／L，與本組術(shù)前、術(shù)后2周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；均明顯高于相同時間點(diǎn)的其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；O組術(shù)后第4、8周餐后血清胰島素水平分別為77.43±1.05mIU／L、77.07±0.96 mIU／L，與本組術(shù)前、術(shù)后2周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；明顯高于相同時間的其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0l）；F組、S組、C組實(shí)驗(yàn)過程中空腹及餐后血清胰島素水平無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

2.3 胰島β細(xì)胞凋亡水平改變

O組大鼠胰島隨著術(shù)后時間的延長，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸減少，至術(shù)后4周下降至5.92±0.74%，至術(shù)后8周凋亡細(xì)胞百分比為6.33±1.08%，細(xì)胞凋亡率明顯低于同時間其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與術(shù)后2周比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；O組術(shù)后第8周細(xì)胞凋亡率略高于第4周，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3、圖9－16）。

表1 各組大鼠血糖變化（mmol／L，±s）

表1 各組大鼠血糖變化（mmol／L，±s）

△ ：與同時間其他各組比較，P＜0.01；★：與同組術(shù)前，術(shù)后1、2W 比較，P＜0.01

組別 術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后4周 術(shù)后8周O組空腹 16.21±0.76 14.08±0.65△ 13.09±0.61△ 9.18±0.61△★ 9.65±0.66△★餐后 31.06±1.10 29.25±1.19△ 26.48±0.76△ 13.11±0.71△★ 12.32±0.66△★S組空腹 15.88±1.03 16.10±1.01 15.56±0.86 16.13±0.62 16.35±0.60餐后 31.32±1.44 30.39±1.56 31.35±1.27 31.03±0.93 31.66±1.17 F組空腹 15.84±1.14 15.53±0.92 13.11±0.66 11.65±0.63 12.00±0.58餐后 30.20±1.31 29.48±1.04 26.78±0.82 24.55±0.74 23.38±0.69 C組空腹 15.82±0.84 15.93±0.78 15.79±0.76 15.99±0.74 16.29±0.60餐后 30.93±1.35 30.19±1.42 30.81±0.78 31.07±1.13 30.96±0.85

表2 各組大鼠血清胰島素濃度變化（mIU／L，±s）

表2 各組大鼠血清胰島素濃度變化（mIU／L，±s）

△：與同時間其他各組比較，P＜0.01；★：與同組術(shù)前、術(shù)后1、2W 比較，P＜0.01。

組別 術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后4周 術(shù)后8周O組空腹 27.95±1.16 29.09±0.96△ 31.33±1.08△ 62.82±1.87△★ 61.64±1.35△★餐后 31.41±0.75 32.60±0.72△ 34.74±0.93△ 77.43±1.05△★ 77.07±0.96△★S組空腹 27.52±1.12 27.46±1.06 27.08±0.78 26.85±0.77 26.85±1.01餐后 31.49±0.90 32.13±0.88 31.26±0.86 31.19±1.21 31.26±1.19 F組空 腹 27.90±1.23 27.30±1.06 28.72±1.02 30.72±1.09 30.17±0.88餐后 31.37±0.79 32.38±0.75 32.60±0.70 33.63±0.86 33.22±0.73 C 組空腹 27.44±1.23 27.40±0.83 26.96±0.81 26.77±0.83 26.57±0.96餐后 31.05±0.79 31.24±0.92 30.64±0.95 30.71±1.24 30.40±1.53

表3 術(shù)后各組大鼠胰島凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡細(xì)胞百分比（%，±s）

表3 術(shù)后各組大鼠胰島凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡細(xì)胞百分比（%，±s）

△ ：與同時間其他各組相比P＜0.01；★：與術(shù)后2W相比，P＜0.01

組別 術(shù)后2w 術(shù)后4w 術(shù)后8w凋亡細(xì)胞數(shù) 百分比O組 18.67±2.25△ 9.33±1.13△ 11.83±1.47△★ 5.92±0.74△★ 12.67±2.16△★ 6.33±1.08凋亡細(xì)胞數(shù) 百分比 凋亡細(xì)胞數(shù) 百分比△★S組 93.33±1.86 46.67±0.93 94.33±1.97 47.17±0.98 94.33±2.07 47.17±1.03 F 組 48.67±2.58 24.33±1.29 42.17±2.32 21.08±1.16 42.33±2.42 21.17±1.21 C 組 92.50±2.88 46.25±1.44 93.00±3.29 46.50±1.44 92.00±2.83 46.00±1.41

3 討論

GBP術(shù)后第4、8周空腹及餐后血糖明顯下降，表明GBP對非肥胖2型糖尿病大鼠的糖代謝具有良好的改善作用。GBP對2型糖尿病大鼠的糖代謝改善作用的機(jī)制可能與減少胰島素抵抗和改善胰島功能有關(guān)［1］。本研究顯示，GBP術(shù)后第4、8周空腹及餐后 胰島素水平 升高。表明GBP手術(shù)可改善胰島β細(xì)胞功能，在治療2型糖尿病中起著重要的作用。

20世紀(jì)80年代便有資料表明2型糖尿病患者胰島β細(xì)胞的數(shù)量明顯下降［4］。事實(shí)上，最近一些通過研究手術(shù)后的胰腺標(biāo)本證實(shí)在2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中，胰島β細(xì)胞數(shù)量的減少和功能的下降起到了重要的作用［2，3］。英國前瞻性糖尿病研究（UKPDS）顯示，2型糖尿病患者無論是否接受強(qiáng)化治療，隨著病程的延長，最終將因胰島β細(xì)胞功能受損導(dǎo)致血糖控制上的惡化。引起胰島細(xì)胞功能障礙的原因比較復(fù)雜，細(xì)胞凋亡是2型糖尿病胰島β細(xì)胞數(shù)量減少的主要原因，凋亡引起的胰島β細(xì)胞數(shù)量減少足以致高血糖。從上世紀(jì)90年代至今的十幾年間，大量的動物學(xué)實(shí)驗(yàn)和人體尸檢研究顯示胰島β細(xì)胞的高水平凋亡在糖尿病發(fā)生前就已存在，糖尿病發(fā)生后，凋亡水平進(jìn)一步增高。胰島β細(xì)胞的凋亡可能是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的一個重要因素，這些細(xì)胞的衰竭最終導(dǎo)致機(jī)體血糖的升高和2型糖尿病的發(fā)生［5］。凋亡的增多或減少都會導(dǎo)致特定疾病的病理生理過程，尤其是細(xì)胞凋亡增多，是導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少和功能下降的重要原因。在2型糖尿病，有多種因素可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致胰島功能受損。文獻(xiàn)報(bào)道，成年高血糖GK大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量下降達(dá)60%［6］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過GBP術(shù)干預(yù)的糖尿病鼠的胰島β細(xì)胞凋亡水平在術(shù)后2、4、8W均顯著低于對照組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），從而證實(shí)GBP術(shù)的確能夠有效降低胰島β細(xì)胞凋亡水平。GBP術(shù)對糖尿病的控制作用，可能就與其抑制β細(xì)胞凋亡，從而有效地保護(hù)胰島細(xì)胞功能和延緩胰島細(xì)胞功能障礙進(jìn)展有關(guān)。

［1］DeFronzo RA.Pharmacologic therapy for type 2diabetes mellitus［J］.Ann Intern Med，1999，131：281.

［2］Butler A E，Janson J，Bonner－Weir S，et al.Betacell deficit and increased beta－cell apoptosis in humans with type 2diabetes［J］.Diabetes，2003，52：102.

［3］Yoon K H，Ko S H，Cho J H，et al.Selective beta－cell loss and alpha－cell expansion in patients with type 2diabetes mellitus in Korea［J］.J Clin Endocrinol，2003，8：2300.

［4］Hellerstrom C.The life story of the pancreatic beta cell［J］.Diabetologia，1984，26：393.

［5］White S，Brooks E，Jurikova L，et al.Long－term outcomes after gastric bypass［J］.Obes Surg，2005，15：155.

［6］Portha B，Giroix M－H，Serradas P P，et al.Beta－cell function and viability in the spontaneously diabetic GK rat.Information fromthe GK／Par colony［J］.Diabetes，2001，50：89.