周 怡，廖 明，何 敏

（廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心，廣西 南寧530021）

SELDI－TOF－MS是一個高通量、高靈敏度的比較蛋白組學(xué)技術(shù)，通過對待測樣品（如血液、組織或細(xì)胞裂解液、尿液、腦脊液、關(guān)節(jié)腔滑液、支氣管洗脫液和各種分泌物等）蛋白指紋圖譜的分析，在疾病的早期診斷、鑒別診斷、預(yù)后判斷和療效觀察方面有一定的應(yīng)用價值［1］。在各種可選的待測樣品中，組織樣品因能直接反映病灶的實質(zhì)倍受研究者的青睞。然而，由于SELDI技術(shù)實驗條件復(fù)雜，不適宜操作導(dǎo)致的結(jié)果偏差常常限制組織樣本的科研應(yīng)用。因此，各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制和優(yōu)化工作就成為亟待解決的問題［2，3］。本研究通過對組織樣本制備、組織裂解液選擇、上樣濃度控制、實驗儀器校準(zhǔn)、實驗結(jié)果重復(fù)性驗證等方面技術(shù)優(yōu)化，初步建立SELDI技術(shù)檢測大鼠肝組織纖維化的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 HPLC水，濃鹽酸，pH3～10兩性電解質(zhì)，蛋白酶抑制劑，CHAPS，DTT，UREA，Tris，TFA，ACN，NaAc等均購自Sigma公司；基質(zhì)（SPA，芥子酸）購自Biorad公司。CM1O蛋白質(zhì)芯片和all－in－one校正芯片購自Ciphergen公司。質(zhì)譜儀為美國CBI（Ciphergen Biosystems Inc）PBSⅡC型表面增強激光解析／電離飛行時間質(zhì)譜儀。采用Ciphergen proteinchip 3.2.1版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù)。

1.2 實驗方法

1.2.1 裂解液的配制 分別制備下列三種不同組分的裂解液，裂解液Ⅰ（7mol／L urea＋2mol／L 硫脲＋2%w／v CHAPS＋40mmol／L Tris＋1%w／v DTT）；裂解液Ⅱ（8mol／L Urea＋4%w／v CHAPS＋40mmol／L Tris＋1%w／v DTT，每25 ml加入蛋白酶抑制劑1片）；裂解液Ⅲ（9mol／L urea＋4%w／v CHAPS＋40mmol／L Tris＋1%w／v DTT＋0.8%pH 3～10兩性電解質(zhì)，每25ml加入蛋白酶抑制劑1片）。

1.2.2 樣本采集和處理 建立大鼠肝纖維化模型，方法參見文獻(xiàn)［4］。將肝纖維化組和對照組大鼠取肝臟組織分別用液氮研磨和勻漿機勻漿破碎，采用上述三種裂解液抽提組織蛋白，定量后分裝于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 all－in－one芯片校準(zhǔn)質(zhì)譜儀 操作按 Ciphergen公司all－in－one芯片說明書中提供的方法和程序進(jìn)行。

1.2.4 CM10芯片捕獲組織樣本中的蛋白：芯片預(yù)濕后，將組織蛋白樣本與CM10結(jié)合緩沖液按體積分?jǐn)?shù)（1∶10、1∶5、1∶2.5、1∶1）混勻，采用CM10芯片捕獲蛋白后上機測定。每個樣本在不同批次CM10芯片的芯池中重復(fù)加樣三次。

1.2.5 SELDI檢測 激光強度230，檢測敏感度9，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍為2 000－20 000，最高分子量為50 000。用 Ciphergen proteinchip 3.2.1和 Biomarker Wizard軟件對各檢測樣本所得圖譜進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 儀器的校準(zhǔn) 如圖1所示，all－in－one芯片含血管加壓素（1 083.6Da）、牛胰島素β鏈（3 496.3 Da）、人胰島素（5 808.2Da）和水蛭素（7 033.8Da）等蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，儀器由Calibration功能進(jìn)行多點校準(zhǔn)后，在all－in－one芯片上檢測到的單電荷蛋白峰的質(zhì)核比與標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的分子量相符。

圖1 儀器校準(zhǔn)的圖譜

2.2 不同裂解方案對組織樣本的處理效力 液氮研磨法／勻漿法破碎后的組織分別用裂解液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處理，蛋白濃度測定顯示，液氮研磨法的產(chǎn)物濃度（18.75±1.76μg／ul）較勻漿法者（11.98±2.56μg／ul）均一且濃度較高；采用CM10芯片捕獲分別經(jīng)裂解液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處理后的組織蛋白，發(fā)現(xiàn)裂解液Ⅲ處理后的組織樣本蛋白質(zhì)峰強度明顯高于裂解液Ⅰ、Ⅱ的產(chǎn)物，且對應(yīng)芯片上檢測到的蛋白質(zhì)峰也較多，結(jié)果見圖2。

圖2 不同組織裂解液的比較

2.3 上樣樣品的濃度 采用液氮研磨法和裂解液Ⅲ處理后的組織樣本，濃度保持在17－20μg／ul水平，將其與CM10結(jié)合緩沖液按體積分?jǐn)?shù)1∶2.5混合上樣（即上樣濃度約為5μg／ul）時，CM10芯片捕獲的蛋白質(zhì)峰數(shù)量和峰強度明顯優(yōu)于1∶10和1∶5混合上樣；當(dāng)以1∶1混合上樣時，盡管CM10芯片捕獲蛋白質(zhì)的峰強度尚可，但基線略漂移且蛋白峰漸現(xiàn)融合趨勢，表現(xiàn)為平頭峰而非高尖峰，結(jié)果見圖3。

圖3 上樣樣品濃度控制的比較

2.4 樣本的重復(fù)性驗證 將大鼠肝纖維化組和對照組各4例樣本按上述優(yōu)化條件處理后，依次結(jié)合在芯片上，平行點三張芯片，采用Biomarker Wizard軟件，分別對各個檢測樣本2 000－20 000KD質(zhì)量范圍內(nèi)的質(zhì)譜峰進(jìn)行統(tǒng)計，計算出三張芯片上各樣本每個質(zhì)譜峰的平均峰強度和方差，由此得到每個質(zhì)譜峰的CV值和每組的平均CV值，如表1所示。兩組平均CV值均在20%之內(nèi)，顯示出良好的重現(xiàn)性。

表1 各檢測樣本質(zhì)譜峰CV值比較

2.5 兩組間的差異蛋白比較 大鼠肝纖維化和對照共8份樣品經(jīng)SELDI－TOF－MS（CM10芯片）共檢測到292個蛋白峰，其中差異表達(dá)蛋白（P＜0.05）54個。與正常組織相比，16種蛋白在纖維化組上調(diào)，而另38種蛋白則下調(diào)。

3 討論

近年來，經(jīng)由SELDI－ProteinChip系統(tǒng)，各國的研究者利用各種體液篩選生物標(biāo)記物或疾病相關(guān)靶，并取得卓越成就。但也有研究人員認(rèn)為，盡管各種體液的獲取過程常具有經(jīng)濟簡便和損傷性小的特點，但體液中往往含有全身各細(xì)胞、組織、器官的分泌物，只能代表生物體的“整體模式”，并不能通過這類樣本知曉具體組織的實際狀態(tài)；組織則不同，不僅能直接反映病灶的實質(zhì)還提供了病灶微環(huán)境的信息，而一些疾病，尤其是在初期本身可能就只影響了局部?；仡橲ELDI技術(shù)中組織樣本的應(yīng)用情況，我們發(fā)現(xiàn)目前國內(nèi)外對組織標(biāo)本研究都不是很多，主要有宮頸癌、肺癌和結(jié)腸癌等，如美國南加州癌癥研究中心的科學(xué)家應(yīng)用SELDI技術(shù)，采集肺組織樣本研究肺癌和癌前病變的蛋白組變化等［5］［6］。這可能是由于組織樣本中除外病變細(xì)胞，還存在炎細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞等混雜細(xì)胞的干擾，近來激光顯微捕獲（LCM）被應(yīng)用到組織樣本的制備中來，可以很好的解決組織中異質(zhì)細(xì)胞的問題［7］。

本研究以大鼠肝纖維化組織為主要研究對象，通過對組織樣本制備、組織裂解液選擇、上樣濃度控制、實驗儀器校準(zhǔn)、實驗結(jié)果重復(fù)性驗證等方面技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，將為利用SELDI技術(shù)檢測各類組織樣本奠定良好基礎(chǔ)。在研究的過程中，病例和對照共兩組樣本檢測到292個蛋白峰，其中差異表達(dá)蛋白54個，在肝纖維化組中表達(dá)上調(diào)16個，表達(dá)下調(diào)38個。對兩組樣本重復(fù)檢測3次，蛋白豐度的平均變異系數(shù)（CV值）分別為0.105和0.155，說明實驗的重復(fù)性佳。后續(xù)，我們將結(jié)合影像學(xué)檢查與病理活檢資料完成人肝纖維化組織樣本的收集和疾病標(biāo)志物的進(jìn)一步篩選工作，為乙型肝炎肝纖維化的早期診斷提供理論依據(jù)。

［1］Seibert V，Wiesner A，Buschmann T，et al.Surface－enhanced laser desorption ionization time－of－flight mass spectrometry （SELDI TOF－MS）and ProteinChip technology in proteomics research［J］.Pathol Res Pract，2004，200（2）：83.

［2］Traum AZ，Wells MP，Aivado M，et al.SELDI－TOF－MS of quadruplicate urine and serum samples to evaluate changes related to storage conditions［J］.Proteomics，2006，6（5）：1676.

［3］Albrethsen J，Bogebo R，Olsen J.Preanalytical and analytical variation of surface－enhanced laser desorption ionization time－offlight mass spectrometry of human serum ［J］.Clin Chem Lab Med，2006，44（10）：1243.

［4］馬學(xué)惠.肝纖維化動物模型的造模方法［J］.中華肝臟病雜志，1996，4（4）：58.

［5］Zhukov TA，Johanson RA，Cantor AB，et al.Discoverv of distinct protein profiles specific for lung tumors and pre－malignant lung lesions by SELDI mass spectrometry［J］.Lung Cancer，2003，40（3）：267.

［6］Chen G，Gharib TG，Huang CC，et al.Proteomic analysis of lung adenocarcinoma identification of highly expressed set of proteins in tumors［J］.Clin Cancer Res，2002，7（8）：2298.

［7］王貴玉，王錫山.SELDI技術(shù)結(jié)合LCM技術(shù)分析結(jié)腸癌細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)構(gòu)成［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，40（2）：131.