趙玲玲，李小翠，劉秀花，畢曉穎，李志超，袁長吉＊

（1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 長春130021）

MMC為烷基汞化合物，具有良好的脂溶性，極易透過血腦屏障；能夠誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生、改變細(xì)胞內(nèi)Ca2＋環(huán)境、影響蛋白質(zhì)的磷酸化、干擾線粒體功能以及DNA的復(fù)治［1］，具有多靶點(diǎn)細(xì)胞毒效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。考慮MMC理化結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及多靶點(diǎn)抗腫瘤效應(yīng)，研究者提出MMC治療白血病的新策略。臨床上常應(yīng)用高劑量甲氨蝶呤（High－dosemethotrexate，HDMTX）治療急性淋巴細(xì)胞白血?。?］（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）。本實(shí)驗(yàn)選擇MTX作為陽性對照，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究MMC誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的情況，有望為白血病的治療提供一種新的化療藥物。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Jurkat細(xì)胞（吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心凍存）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（美國 Gibco公司）；MTT（北京鼎國生物技術(shù)有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma）；AnnexinⅤ－FITC／PI凋亡試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；酶標(biāo)儀（美國Bio－Rad Model 550）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Jurkat細(xì)胞，在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2－3天換液傳代1次，傳至2－3代后取對數(shù)生長期細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT比色法檢測MMC和MTX對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制率 分別取對數(shù)期生長期Jurkat細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個·mL－1，每孔90μl接種于96孔板中。分別取1.25、2.5、5、10和20μmol·L－1的 MMC或 MTX 10μl加入到對數(shù)期生長的Jurkat細(xì)胞中，設(shè)3個平行復(fù)孔。藥物作用24小時后，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。每孔加入 MTT 20μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)4小時，1 000r·min－1離心5min，棄上清，每孔加入DMSO 150μl，充分混勻后用用酶標(biāo)儀570nm測定各孔吸光度值（A值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率＝（1－（實(shí)驗(yàn)組A值－調(diào)零孔A值）／（對照組A值－調(diào)零孔A值））×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡率檢測 分組同上，常規(guī)收集細(xì)胞，應(yīng)用2.50、5.00、10.00和20.00μmol·L－1MMC和MTX作用24h，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整至1×105個·mL－1，各取1ml，1000r·min－1離心5min，棄上清，加入195μl Annexin V－FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；加入5μl Annexin V－FITC，混勻后室溫避光孵育10分鐘；1 000r·min－1離心5min，棄上清，加入190μl Annexin V－FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；加入10μl PI染色液，混勻后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 細(xì)胞增殖抑制率以±s表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MMC和MTX對Jurkat細(xì)胞增殖抑制作用MTT結(jié)果顯示不同劑量的MMC和MTX作用Jurkat細(xì)胞24h，隨著劑量的增加，其對細(xì)胞增殖的抑制率逐漸上升，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。在10 μmol·L－1藥物濃度下，MMC組較MTX組細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，兩組差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 不同藥物對Jurkat細(xì)胞增殖抑制率（24h，n＝3，±s，η／%）

表1 不同藥物對Jurkat細(xì)胞增殖抑制率（24h，n＝3，±s，η／%）

＊ 與MTX組對比P＜0.05

MMC／MTX（μmol·L－1）rates MMC group MTX group Inhibitory 1.25 11.42±1.22 6.72±1.37 2.50 13.90±1.28 11.73±1.22 5.00 17.51±1.21 14.36±1.95 10.00 65.52±2.99 34.62±2.53 20.00 89.16±2.55 42.83±3.25

2.2 MMC和MTX對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響 應(yīng)用AnnexinⅤ／PI雙染法進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測，結(jié)果顯示，對照組凋亡率（0.15±0.03）%，10μmol·L－1的MMC和MTX誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的凋亡率分別為（54.65±3.15）%，（26.32±2.64）%；實(shí)驗(yàn)組較對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且MMC組與 MTX組相比較差異有顯著性（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 不同藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度MMC和MTX均可抑制Jurkat細(xì)胞增殖，且抑制率與濃度正相關(guān)；Jurkat細(xì)胞接觸10μmol·L－1的 MMC凋亡率開始明顯增加，且與同濃度MTX作用相比較差異有顯著性?？梢奙MC有促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的作用，與MTX相比其誘導(dǎo)凋亡作用更為顯著。

ALL是兒童惡性腫瘤中最常見的疾病，占小兒惡性腫瘤的50%左右［3］。因其極易發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，死亡率較高。因此尋找一種新的能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并容易透過血腦屏障的藥物是目前淋巴細(xì)胞白血病治療亟待解決的問題。臨床上常用甲氨蝶呤進(jìn)行治療，使用常規(guī)劑量的MTX很難通過人體內(nèi)的“血腦屏障”，“血睪屏障”等，極易導(dǎo)致中樞浸潤或疾病復(fù)發(fā)。HDMTX能夠透過上述屏障，達(dá)到治療的目的。但是隨著藥物劑量的加大其毒副作用也隨之增加，臨床上很多病人往往很難承受化療藥物帶來的這一不良作用［4，5］。MMC屬于烷基汞化合物，具有良好的脂溶性，極易透過血腦屏障。具有多靶點(diǎn)細(xì)胞毒效應(yīng)，可引起DNA斷裂，其烷基結(jié)構(gòu)能與DNA堿基相互作用形成雙鏈內(nèi)及鏈間交聯(lián)，影響 DNA 復(fù)制［6］，誘導(dǎo)自由基的生成［7］；同時影響細(xì)胞內(nèi)Ca2＋環(huán)境，升高細(xì)胞內(nèi) Ca2＋負(fù)載［8］；并影響線粒體膜電位，改變其膜通透性，使細(xì)胞色素C釋放至胞漿并與Apaf－1結(jié)合，引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［1］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí) MMC能夠有效誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，且較MTX作用顯著；同時MMC為脂溶性化合物，極易透過血腦屏障，能夠起到預(yù)防和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的作用。有望為白血病的臨床治療提供一種新的化療藥物。

MMC對各種蛋白質(zhì)和氨基酸的巰基有極高的親和力。而調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖的許多酶都含有巰基，巰基是其作用的觸發(fā)器，MMC與巰基結(jié)合后可干擾酶的活性，并影響線粒體的功能，影響細(xì)胞呼吸和氧化磷酸化過程，繼而發(fā)生一系列抗癌的分子生物學(xué)事件［9，10］。MMC抑制Jurkat細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡可能與上述機(jī)制存在密切的關(guān)聯(lián)。我們會在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制。

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