萬法青，劉易軍，單玉興＊，張海玉

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院1.二部骨科；2.兒外科，吉林 長春130000）

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年。具有瘤細(xì)胞增殖迅速、惡性度高、易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。治療以手術(shù)為主的綜合治療，化療藥物主要用甲氨蝶呤（MTX）、順鉑、異環(huán)磷酰胺、阿霉素等。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用甲氨蝶呤作用于骨肉瘤細(xì)胞株（HOS），觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響及對(duì)端粒酶活性的作用。進(jìn)而研究甲氨蝶呤的抑癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人骨肉瘤（HOS）細(xì)胞株購自北京鼎國生物；胎牛血清Hyclone公司；MEM培養(yǎng)基Gibco公司；甲氨蝶呤上海醫(yī)藥有限公司；BCA蛋白試劑盒、四氮甲唑藍(lán)（MTT）碧云天公司；TRAPPCR－ELISA試劑盒德國寶靈曼公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤HOS細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清MEM培養(yǎng)基中，置5%CO2、飽和濕度37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞（制備細(xì)胞懸液為1×106／ml），接種于96孔板，每孔100μl。設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，次日分別加入100μl經(jīng)培養(yǎng)液稀釋好的不同濃度的藥物及相同體積的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后加入MTT（5g／L）20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，每孔加150μl DMSO，終止培養(yǎng)，室溫振蕩約10 min，充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。用 Model－450酶標(biāo)儀（Bio－Bad）測定波長490nm處的吸光度（A）值。細(xì)胞存活率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組A值／對(duì)照組A值）×100%，細(xì)胞抑制率（%）＝1－細(xì)胞存活率，抑制率達(dá)到50%為最佳作用時(shí)間和濃度，并測定端粒酶活性改變的藥物濃度和作用時(shí)間。

1.2.3 TRAP－PCR－ELISA 方法檢測端粒酶活性，按試劑盒說明書操作 收集細(xì)胞沉淀用冷洗液懸浮，冰浴5min，4℃高速離心（10 000rpm）5min。沉淀與冷的裂解緩沖液冰浴30min，其間渦旋振蕩3－5次，4℃高速離心（13 000rpm）30min，上清即所需的提取液，吸取上清液至EP管中，分裝，20μl／管，BCA法測定其中一份蛋白濃度，其余－70℃保存?zhèn)溆?。TRAP－PCR反應(yīng)：在0.2ml擴(kuò)增管中依次加入25μl反應(yīng)混合物，3μl細(xì)胞裂解產(chǎn)物，加無菌水至終體積50μl。PCR步驟：25℃30min引物延伸；94℃5min端粒酶滅活；之后94℃30s，50℃30s，72℃90s共循環(huán)36個(gè)周期后72℃10min進(jìn)一步延伸。4℃保存PCR產(chǎn)物。ELISA反應(yīng)：PCR產(chǎn)物與變性劑以及雜交緩沖液反應(yīng)后，取100μl加入有親合素包被的反應(yīng)孔中37℃振蕩孵育2h。洗滌后，于各孔中加入抗地高辛－過氧化物酶，室溫下振蕩30min。洗滌，再依次加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和終止液，從酶標(biāo)儀上讀取其在450nm處的吸光度A值。65℃水浴10min加熱滅活的（HOS）細(xì)胞提取液作陰性對(duì)照，陽性對(duì)照于試劑盒內(nèi)提供。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT法） 采用MTT法檢測MTX對(duì)HOS細(xì)胞生長的影響。結(jié)果如圖1所示，MTX可以明顯抑制HOS細(xì)胞的增殖，MTX對(duì)HOS細(xì)胞的毒性作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，即MTX對(duì)HOS細(xì)胞的毒性作用呈濃度依賴性，同劑量MTX對(duì)HOS細(xì)胞的毒性作用隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)，即呈時(shí)間依賴性。MTX對(duì)HOS細(xì)胞株的半數(shù)致死濃度（IC50）為100mg／L。

圖1 MTX作用于骨肉瘤細(xì)胞株HOS后細(xì)胞抑制率

2.2 端粒酶活性改變 實(shí)驗(yàn)組為MTX作用組，對(duì)照組為未加任何藥物的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組吸光度值A(chǔ)值與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)MTX作用后HOS細(xì)胞端粒酶活性受到明顯抑制，P＜0.05，端粒酶活性下調(diào)率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組平均A值－對(duì)照組平均A值）／對(duì)照組平均A值×100%。MTX作用后HOS細(xì)胞株端粒酶活性下降了47.49%，這表明MTX可以明顯抑制HOS細(xì)胞株端粒酶活性。

3 討論

甲氨蝶吟（MTX）為抗葉酸類抗腫瘤藥，對(duì)多種腫瘤具有良好的抗腫瘤活性［1］。主要通過對(duì)二氫葉酸還原酶的抑制來阻礙嘌呤核苷酸的合成進(jìn)而達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)及細(xì)胞生長與繁殖的抑制。本藥選擇性地作用于細(xì)胞周期中的S期，是骨與軟組織腫瘤化療的首選藥物。張永民［2］等研究發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨肉瘤細(xì)胞有一定的抑制作用且隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。李萍［3］等研究也發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤對(duì)破骨細(xì)胞的增殖、骨吸收等均有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)表明MTX對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株（HOS）有明顯的抑制作用，且呈時(shí)間和濃度依賴性。進(jìn)一步證實(shí)了MTX對(duì)體外培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞株的生長抑制作用。

端粒酶是一種RNA依賴的DNA聚合酶，端粒酶的激活使端粒的長度得以穩(wěn)定，細(xì)胞獲得無限增殖能力成為永生化細(xì)胞［4］。端粒酶的作用是將端粒序列添加到染色體的末端。因此，端粒酶是在細(xì)胞周期的S期發(fā)揮作用的［5］。進(jìn)年來有研究表明，在84%的骨肉瘤、60%的軟骨肉瘤中可檢測到端粒酶活性的表達(dá)，而在瘤旁正常組織中卻檢測不到［6］，因此端粒酶可能成為治療腫瘤的新靶點(diǎn)。有報(bào)道稱順鉑可以抑制大腸癌細(xì)胞HT－29細(xì)胞的端粒酶活性［7］。而MTX對(duì)端粒酶活性的作用報(bào)道卻很少，本實(shí)驗(yàn)表明MTX可以明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞株（HOS）端粒酶活性，下調(diào)率為47.49%。這可能與MTX選擇性的作用于細(xì)胞周期中的S期有關(guān)。但是其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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［6］Wen JM，Sun LB，Zhang M，et al.Anon－isotopic method for the detection of telomerase activityin tumour tissues：TRAP－silver staining assay［J］.Mol Pathol，1998，51：110.

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