司徒博，曹楠楠，劉麗琴，李 博，劉芹蘭，林 麗，王 前，鄭 磊＊

（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州510515；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，廣東 廣州510010）

RAS／RAF／MEK／ERK／MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生物學(xué)事件。BRAF基因的編碼產(chǎn)物的是參與該通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種重要絲氨酸／蘇氨酸激酶，該基因的15外顯子1799位核苷酸的T→A突變是BRAF基因的熱點(diǎn)突變（約占80%－90%）［1］，此突變使其編碼的氨基酸由纈氨酸變?yōu)楣劝彼幔╒600E），導(dǎo)致該激酶活性大大增強(qiáng)，能持續(xù)激活MAPK信號(hào)通路，致使細(xì)胞異常增殖及分化，被認(rèn)為是細(xì)胞癌變的關(guān)鍵因素［2，3］。在結(jié)直腸腫瘤治療中，BRAF V600E突變情況被認(rèn)為是除KRAS突變外對(duì)分子靶向藥物西妥昔單抗與帕尼單抗的療效預(yù)測(cè)的另外一個(gè)重要指標(biāo)［4，5］。此外，突變的BRAF基因也是結(jié)直腸腫瘤預(yù)后較差的一個(gè)生物標(biāo)志物［6］，以及區(qū)分散發(fā)性結(jié)直腸癌與Lynch綜合征的分子指標(biāo)［7］。因而，準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤組織中BRAF基因的突變情況具有重要的診療意義。本研究以人BRAF基因V600E突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)等位基因特異性擴(kuò)增引物，通過(guò)選擇性擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)檢測(cè)BRAF基因熱點(diǎn)突變的目的，通過(guò)與金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法比較，探討該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人大腸癌SW480及HT29細(xì)胞分別由南方醫(yī)院消化科及廣州軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科惠贈(zèng)。兩株細(xì)胞均經(jīng)過(guò)測(cè)序證實(shí)分別為BRAF野生型及攜帶BRAF V600E雜合突變。

1.1.2 結(jié)直腸癌標(biāo)本 40例結(jié)直腸癌石蠟標(biāo)本來(lái)源于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科。所有提取DNA腫瘤組織切片均經(jīng)鏡檢證實(shí)腫瘤細(xì)胞含量大于90%。

1.1.3 試劑與儀器 細(xì)胞核酸提取試劑盒（美國(guó)Omega公司），石蠟組織核酸提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），TaKaRa TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），瓊脂粉（西班牙Biowest公司）。Nanodrop2000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司），PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司），凝膠成像儀（美國(guó)Bio－Rad公司）。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)及合成 針對(duì)人BRAF基因V600E位點(diǎn)設(shè)計(jì)3’末尾堿基錯(cuò)配的上游引物：TGATTTTGGTCTAGCTACAGA，下游引物：TTTCAACAGGGTACACAGAACA，下劃線堿基與BRAF野生型模板15外顯子1799位堿基錯(cuò)配，與突變熱點(diǎn)V600E匹配而達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為490bp。測(cè)序引物擴(kuò)增范圍覆蓋BRAF基因第15外顯子V500E突變位點(diǎn)：上游引物：AGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACC，下游引物：AATCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTCT，擴(kuò)增片段184bp。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成 ，PAGE純化。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 分別用細(xì)胞核酸提取試劑盒及石蠟組織核酸提取試劑盒對(duì)細(xì)胞及腫瘤標(biāo)本進(jìn)DNA提取，模板DNA置－20℃保存。

1.2.2 等位基因特異性擴(kuò)增 對(duì)人大腸癌細(xì)胞株SW480、HT29以及40例腫瘤標(biāo)本進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增，條件如下：PCR體系總體積為20μl，含Mg2＋buffer 2μl，dNTP mixture 1.5μl（各 2.5 mM），上下游引物各0.5μl（10umol），模板 DNA 30ng，加滅菌去離子水至20μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s，67℃退火20s，72℃延伸30s，共45個(gè)循環(huán)。腫瘤標(biāo)本取1μl第一次擴(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)行二次擴(kuò)增，擴(kuò)增條件一致。PCR產(chǎn)物取5μl進(jìn)行瓊脂糖（2%）凝膠電泳30min后顯像。

1.2.3 普通PCR并測(cè)序 所有標(biāo)本及細(xì)胞株均經(jīng)PCR后測(cè)序與等位基因特異性擴(kuò)增結(jié)果作比較。PCR反應(yīng)條件：含 Mg2＋buffer 2μl，dNTP mixture 1.5μl（各2.5mM），上下游引物各1μl（10μmol），模板DNA 30ng，加滅菌去離子水至20μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s，54℃退火20s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖（2%）凝膠電泳證實(shí)目的條帶擴(kuò)增成功后送測(cè)序（華大基因有限公司）。

1.2.4 靈敏度檢測(cè) 取SW480及 HT29細(xì)胞株DNA經(jīng)核酸定量?jī)x均定量為30ng后，按一定比例用攜帶有BRAF野生型（SW480）的核酸混合到帶有BRAF V600E突變（HT29）的核酸中，得到分別含有50%、25%、12.5%、6.2%、3.1%、1.5%的突變DNA的混合模板，分別取30ng進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增與普通PCR后測(cè)序進(jìn)行靈敏度比較。

2 結(jié)果

2.1 等位基因特異性擴(kuò)增BRAF V600E突變結(jié)果 在上述PCR條件下，該方法成功選擇擴(kuò)增出攜帶有BRAF V600E雜合突變的細(xì)胞株（圖1）。而在40例大腸癌石蠟標(biāo)本中，3例出現(xiàn)了目的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2）。

圖1 不同比例的BRAF V600E突變核酸經(jīng)等位基因特異性擴(kuò)增后行瓊脂糖凝膠電泳

圖2 利用等位基因特異性擴(kuò)增檢測(cè)40例大腸癌石蠟標(biāo)本

2.2 普通PCR后測(cè)序結(jié)果 40例大腸癌石蠟標(biāo)本經(jīng)成功擴(kuò)增后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示40例標(biāo)本中37例BRAF基因15外顯子1799位核苷酸為野生型，3例為BRAF V600E突變，檢測(cè)結(jié)果與等位基因特異性擴(kuò)增結(jié)果一致。

2.3 兩種方法靈敏度比較 如圖1顯示，通過(guò)等位基因特異性擴(kuò)增不同比例突變核酸，本方法可在6.2%的突變基因模板中擴(kuò)增出目的條帶，顯示本方法檢測(cè)BRAF V600E突變的敏感度可低至6.2%。普通PCR后測(cè)序結(jié)果則能從峰圖中顯出50%、25%、12.5%的突變位點(diǎn)，低于12.5%則與背景信號(hào)混雜無(wú)法測(cè)出（圖3）。

圖3 不同比例的BRAF V600E突變核酸經(jīng)普通PCR后測(cè)序的信號(hào)峰圖

3 討論

腫瘤是由于細(xì)胞在致癌因素的影響下發(fā)生基因變異，從而失去對(duì)生長(zhǎng)的正常調(diào)控而導(dǎo)致的單克隆性異常增生所致。其中，被認(rèn)為對(duì)腫瘤形成起重要作用的突變被稱為“驅(qū)動(dòng)突變”（Driver Mutation），準(zhǔn)確、敏感地檢測(cè)該類突變可作為腫瘤的生物標(biāo)志物從而對(duì)腫瘤的分子診斷提供重要信息。BRAF V600E突變已被證實(shí)出現(xiàn)于甲狀腺癌、大腸癌、惡性黑素瘤、肺癌、毛細(xì)胞白血病等多種腫瘤中［8］，在腫瘤的早期診斷、鑒別診斷、預(yù)后判斷以及分子分型中起了重要作用。近年來(lái)，隨著分子靶向藥物的不斷研發(fā)，作用于BRAF突變蛋白的靶向藥物也陸續(xù)進(jìn)入臨床。目前該基因突變情況被認(rèn)為是對(duì)大腸癌［9］、惡性黑素瘤［10］分子靶向藥物療效預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)而受到人們的日益重視。由于靶向藥物往往價(jià)格昂貴且毒副作用明顯，因而準(zhǔn)確、敏感地檢測(cè)出判斷其療效的基因突變情況具有重要的指導(dǎo)意義。然而，眾多晚期腫瘤患者初診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，檢測(cè)腫瘤源性的突變基因情況只能通過(guò)穿刺組織活檢、胸腹水等檢測(cè)。該類標(biāo)本腫瘤細(xì)胞豐度低且混雜了大量正常的體細(xì)胞，即使是腫瘤組織本身，也?；祀s了大量野生型的體細(xì)胞。目前檢測(cè)突變的常用方法有測(cè)序、RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）、熒光定量PCR、dHPLC（變性高效液相色譜）、HRM（高分辨率溶解曲線）等，RFLP與SSCP存在步驟繁瑣、敏感性欠佳的缺點(diǎn)；定量PCR、HRM及dHPLC均需要特殊設(shè)備或標(biāo)記探針；被認(rèn)為是基因檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”的測(cè)序法往往需要昂貴的測(cè)序儀器及較復(fù)雜操作要求，且成本較高、操作耗時(shí)，一般實(shí)驗(yàn)室難以開展。此外，臨床上利用測(cè)序作為檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)室為避免假陰性，往往拒收腫瘤細(xì)胞含量低于50%的標(biāo)本，導(dǎo)致了一部分晚期腫瘤病人對(duì)靶向治療選擇無(wú)據(jù)可循。

等位基因特異性擴(kuò)增是檢測(cè)已知突變的一種簡(jiǎn)便方法，該方法利用Taq酶缺少3’→5’外切酶活性，引物3’末端堿基與模板錯(cuò)配時(shí)，擴(kuò)增難以進(jìn)行的原理，而達(dá)到選擇性擴(kuò)增定點(diǎn)突變或野生型基因的目的。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)上游引物3’端與BEAF基因V600E點(diǎn)突變完全互補(bǔ)、與野生型堿基錯(cuò)配的上游引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，從而達(dá)到選擇性擴(kuò)增BRAF V600E突變的目的。通過(guò)利用攜帶V600E突變的HT29細(xì)胞與BRAF野生型的SW480大腸癌細(xì)胞株的模板稀釋實(shí)驗(yàn)，證實(shí)該方法可檢測(cè)出混雜于野生型中的6.2%BRAF突變，與測(cè)序相比（12.5%）本方法具有更高的靈敏度。利用本研究建立方法檢測(cè)40例大腸癌石蠟標(biāo)本，成功檢測(cè)出3例，與PCR后測(cè)序結(jié)果對(duì)比一致。

綜上所述，等位基因特異性擴(kuò)增可快速檢測(cè)出腫瘤BRAF基因V600E突變，與測(cè)序法相比，本方法無(wú)需特殊設(shè)備，具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，較適合普通實(shí)驗(yàn)室對(duì)腫瘤突變基因的篩查檢測(cè)。

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