李 歡，高 垚，王歡歡，常 穎＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)一科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130051）

羊水干細(xì)胞是近幾年來(lái)備受關(guān)注的一類具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞，在體外不同的誘導(dǎo)條件下，可以向神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分化［1］。本實(shí)驗(yàn)探討了在體外特定的誘導(dǎo)條件下，成人羊水干細(xì) 胞 （human amniotic fluid－derived stem cells，hFSCs）向神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)化的規(guī)律，為羊水干細(xì)胞應(yīng)用于臨床提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 AmnioMAX－Ⅱ培養(yǎng)基

α－MEM（Gibco公司）；胎牛血清、HEPES緩沖液、bFGF（Hyclo ne公司；胰蛋白酶、β－巰基乙醇（Sigma公司）；熒光素標(biāo)記小鼠抗人CD44、CD45抗體（eBioscience公司）；鼠抗人的 NSE、GFAP（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus）；YJ－2操凈臺(tái) （蘇州凈化設(shè)備廠）；CO2孵箱（SANYO日本）

1.2 方法

1.2.1 hAFC的原代培養(yǎng) 羊水標(biāo)本來(lái)自懷孕16－22周行產(chǎn)前檢查或自愿引產(chǎn)的孕婦，在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺取得20ml羊水。取標(biāo)本前均征得孕婦本人同意，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。羊水標(biāo)本在室溫下1000／min離心5min，棄上清，加入AmnioMAX－Ⅱ培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱，出現(xiàn)梭形細(xì)胞為主、類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞集落且達(dá)70%匯合后，0.25%胰蛋白酶1mmol·L－1EDTA消化后，改用α－MEM＋10%胎牛血清＋4 μg／LbFGF培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)，記為第1代（P1）。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí)按1∶4的比例傳代。

1.2.2 hAFC的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)一旦鋪滿整個(gè)培養(yǎng)板的底部，即可用0.25%胰蛋白酶1mmo l·L－1EDTA液消化、分離，然后按3×104／cm2密度傳代接種于6孔培養(yǎng)板中，并記為P1；傳代培養(yǎng)直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)板的底面；再重復(fù)以上操作，并記為P2，以此類推，傳代培養(yǎng)直至細(xì)胞出現(xiàn)衰老征相。傳代培養(yǎng)的接種密度嚴(yán)格控制在與原代培養(yǎng)接種密度相同的水平以便于對(duì)照。

1.2.3 hAFC細(xì)胞表面分子測(cè)定 第10代細(xì)胞80%～90%融合后，用0.25%胰酶1mmol·L－1EDTA液消化細(xì)胞，制成2×105／mL的單細(xì)胞懸液，分別加入3個(gè)Eppendof管中。A管為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，加入5μL IgG1－FITC的單克隆抗體；B管加入5μLCD44－FITC單克隆抗體；C管加入5μL CD45－FITC單克隆抗體，室溫反應(yīng)30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 羊水細(xì)胞核型分析 取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞第10代、20代羊水干細(xì)胞進(jìn)行核型分析。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入秋水仙素，培養(yǎng)4h后胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后固定、制片、Gimsa染色后鏡下觀察并分析結(jié)果。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分兩組 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組又分：NSE組、GFAP組和尼氏染色組，每組包括18個(gè)細(xì)胞爬片。將第10代的hFSCs按3×103／cm2接種于24孔培養(yǎng)板中（預(yù)先放置經(jīng)賴氨酸處理的蓋玻片。細(xì)胞80%～90% 融合后，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用含20%FCS、10ng／ml bFGF的α－MEM 預(yù)誘導(dǎo)24h，更換培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，再加入含5 mmol／Lβ－巰基已醇的無(wú)血清α－MEM進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)5h，然后進(jìn)行尼氏體及免疫組織化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組用未誘導(dǎo)的hFSCs爬片直接進(jìn)行NSE、GFAP染色。誘導(dǎo)后的細(xì)胞染色后隨機(jī)取10個(gè)非重疊視野（×100），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 hAFC的分離、純化、擴(kuò)增 原代培養(yǎng)4d可見(jiàn)有細(xì)胞貼壁，平均7d左右散在的梭形細(xì)胞為主、類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞集落。平均14天左右可達(dá)80%融合。傳代培養(yǎng)后，12h即可貼壁，細(xì)胞呈較均一的長(zhǎng)梭形，7d左右細(xì)胞可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底面，可繼續(xù)傳代擴(kuò)增。傳代后的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2 hAFC表型 hFSC均一表達(dá)CD44，但CD45陰性。

2.3 第10代、20代羊水干細(xì)胞檢測(cè)干細(xì)胞核型正常，為46XX和46XY。

2.4 hFSC向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)變化誘導(dǎo)30min，即發(fā)現(xiàn)原來(lái)大而扁平的hMFSCs胞體發(fā)生收縮；誘導(dǎo)2h后，細(xì)胞進(jìn)一步收縮，胞體由長(zhǎng)梭形逐漸變成圓形或類圓形，立體感增強(qiáng)，有許多細(xì)的指狀突起（見(jiàn)圖1a）。5h后細(xì)胞形態(tài)基本不再發(fā)生變化，有80%以上的細(xì)胞呈典型的神經(jīng)元樣形態(tài)，多個(gè)神經(jīng)樣細(xì)胞的突起可相互延伸形成網(wǎng)狀（見(jiàn)圖1b）。6h以后，大部分細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫落，死亡。對(duì)照組細(xì)胞仍然保持寬大扁平的狀態(tài)。

圖1a 誘導(dǎo)2h細(xì)胞形態(tài)的改變×200

圖1b 誘導(dǎo)5h細(xì)胞形態(tài)改變×200

2.5 尼氏染色 第10代hFSCs誘導(dǎo)2h后，神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)中未見(jiàn)深藍(lán)色的尼氏體；在誘導(dǎo)5h后的胞漿中均可見(jiàn)深藍(lán)色的顆粒狀尼氏體，未誘導(dǎo)的hFSCs胞漿中未見(jiàn)明顯的深藍(lán)色尼氏體結(jié)構(gòu)。

2.6 免疫組織化學(xué)染色 未誘導(dǎo)的hFSCs不表達(dá)NSE、GFAP。誘導(dǎo)5h后的細(xì)胞表達(dá)NSE，不表達(dá)GFAP（見(jiàn)圖2a）；NSE陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為彌漫性胞漿棕褐色著色（見(jiàn)圖2b），誘導(dǎo)5hNSE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（79.8±1.9）%。

圖2 a 向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)5hNSE染色×200

圖2 b 向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)5hGFAP染色×200

3 討論

隨著組織工程的興起和發(fā)展，細(xì)胞替代治療將成為攻克一些疑難病癥的新途徑。目前，科學(xué)家們真在嘗試通過(guò)組織工程技術(shù)將組織干細(xì)胞體外擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)為所需細(xì)胞，然后植入患者體內(nèi)，用以修復(fù)損傷、替代退行性組織以及改善遺傳性缺陷組織的功能。羊水干細(xì)胞最早是在2003年被Prusa［2］等發(fā)現(xiàn)；2007年，Paolo［3］等將由羊水中分離獲得的干細(xì)胞命名為羊水干細(xì)胞（AFC），這種細(xì)胞表達(dá)MSC（Mesenchymal stem cell）、不表達(dá)造血細(xì)胞系標(biāo)記，90%的細(xì)胞表達(dá)Oct－4；這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了羊水干細(xì)胞研究的熱潮，羊水干細(xì)胞有望成為新的干細(xì)胞種子來(lái)源，應(yīng)用于細(xì)胞及基因治療。

FSCs在羊水中的峰度并不高［4］，因此在體外條件下進(jìn)行分離、純化并實(shí)行體外擴(kuò)增就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用羊水專用培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司AminioMAX－Ⅱcomplete培養(yǎng)基），結(jié)合機(jī)械分離方法從羊水中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，并成功的在體外擴(kuò)增。雖然目前國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家都致力于羊水干細(xì)胞的研究，但尚未發(fā)現(xiàn)AFC特征性的表面標(biāo)記。AFC在細(xì)胞表型上類似于胚胎干細(xì)胞和成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，即SH2、CD44和CD90陽(yáng)性，CD34、CD45 和 CD117HLADR 陰 性［5］；在 AFSC表面標(biāo)記中引人注意的是POU轉(zhuǎn)錄因子4（Oct－4）等胚胎特異性標(biāo)記的表達(dá)［6］，提示羊水中存在比間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育更原始、增殖和分化能力更強(qiáng)、更接近于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表達(dá)MSC細(xì)胞表面標(biāo)記CD44，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD45，因此證明我們培養(yǎng)的羊水細(xì)胞是具有MSC特性的干細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù) Tsai［7］和Paolo［8］及王晗［9］的方法，取擴(kuò)增第10代的hMFSC，先用含細(xì)胞用含20%FCS、10ng／ml bFGF的α－MEM 預(yù)誘導(dǎo)24h，更換培養(yǎng)液，再用含5mmol／Lβ－巰基乙醇的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液向神經(jīng)細(xì)胞方向進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)5h后的hMFSCs均一表達(dá)NSE，胞質(zhì)中可見(jiàn)深藍(lán)色的神經(jīng)元細(xì)胞特有的尼氏體結(jié)構(gòu)。

NSE和GFAP均為一種胞漿蛋白，NSE主要表達(dá)于神經(jīng)元；GFAP主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)hFSCs誘導(dǎo)后，免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的細(xì)胞均表達(dá)NSE，而不表達(dá)GFAP。組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有神經(jīng)元的特有結(jié)構(gòu)尼氏體形成。說(shuō)明BME的誘導(dǎo)具有定向性，主要是向神經(jīng)元細(xì)胞分化，而不是向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。

體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞目前主要有兩種方法，抗氧化劑［10］和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)［11］，抗氧化劑快速、分化率較高，但細(xì)胞不能長(zhǎng)期存活；生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后的細(xì)胞存活時(shí)間較長(zhǎng)，但分化率較低。BME作為一種強(qiáng)的抗氧化劑，它的這種定向誘導(dǎo)作用可能與其能將細(xì)胞從氧化狀態(tài)中釋放出來(lái)有關(guān)，但具體的作用機(jī)理還不十分清楚；而且做為強(qiáng)氧化劑，BME對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，因此在體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞在BME誘導(dǎo)液中不能長(zhǎng)期存活，在6h后，大部分細(xì)胞從培養(yǎng)板中脫落下來(lái)，死亡。一些實(shí)驗(yàn)表明：在一定的神經(jīng)生長(zhǎng)因子存在的情況下，hFSCs可以向多巴胺能神經(jīng)元定向分化5。這表明，hFSCs向不同的方向分化需要不同的環(huán)境條件，細(xì)胞的定向分化性是受周?chē)h(huán)境因素影響和決定的，因此對(duì)這些分化機(jī)理的深入研究，將最終使我們更廣泛地應(yīng)用組織工程進(jìn)行細(xì)胞替代治療。

從實(shí)驗(yàn)中我們可以看到，hFSCs在BME誘導(dǎo)下，可定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，細(xì)胞表達(dá)NSE，但誘導(dǎo)后的細(xì)胞不能長(zhǎng)期存活，體外存活時(shí)間短；但文獻(xiàn)報(bào)道的采用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作為誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)中，雖誘導(dǎo)后的類神經(jīng)元細(xì)胞可存活時(shí)間較長(zhǎng)，但誘導(dǎo)分化的陽(yáng)性率較低。hMFSCs作為細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞，如何找到誘導(dǎo)后既能長(zhǎng)期存活，又能有較高誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率的適宜體外誘導(dǎo)條件，是值得我們進(jìn)一步研究、探索的問(wèn)題。

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