唐耘天，李辛平，劉天奇，楊建榮，羅建強(qiáng)，梁中驍

（廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 肝膽外科，廣西 南寧530021）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)男性常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)［1］。流行病學(xué)研究表明：黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）暴露和乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是肝癌發(fā)生的高危因素。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的進(jìn)展，肝癌與基因多態(tài)性的研究日益受到重視。AFB1的主要代謝解毒酶－谷胱 甘 肽 巰 基 轉(zhuǎn) 移 酶 （Glutathione S－transferase，GSTs），其基因多態(tài)性與腫瘤的關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)。本研究選取GSTs家族中的GSTM1、GSTT1、GST01、GSTP1，采 用 Multiplex－PCR 和PCR－RFLP技術(shù)檢測(cè)肝癌患者和健康對(duì)照者的GSTM1、GSTT1缺失情況，及 GST01－Ala140Asp、GSTP1－Ile105Val位點(diǎn)的多態(tài)性，并加以比較研究，探尋GSTs基因多態(tài)性與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 肝癌組為本院2008年10月至2010年10月住院已經(jīng)病理證實(shí)的男性原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者150例，年齡23－62歲。對(duì)照組為男性體檢健康者150例年齡25－65歲。兩組年齡分布具有可比性（P＞0.05）。

1.2 試劑和儀器 DNA抽提試劑盒（Qiagen公司）、PCR引物（上海捷瑞生物工程有限公司）、限制性?xún)?nèi)切酶（New England Biolabs公司）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（MJ Research公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采EDTA抗凝靜脈血，離心分層獲取中間層多核細(xì)胞。GSTM1和GSTT1采用多重PCR（Multiplex－PCR）檢驗(yàn)，以β－珠蛋白（β－globin，268bp）為參照基因；GST01－Ala140Asp、GSTP1－Ile105Val位點(diǎn)采用 PCR－RFLP技術(shù)。受檢各基因各位點(diǎn)檢測(cè)參考文獻(xiàn)方法［2－4］。PCR基本反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2min、94℃變性15s、62℃退火30s、72℃延伸30s，共約35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min（各基因位點(diǎn)略有不同）。PCR反應(yīng)體系容積為25μl：0.25μl Platinum Taq polymerase（1.25μ）、2.5μl 10×PCR buffer、0.8μl MgCl2（50mM）、0.5 μl deoxynucleotide triphosphate（dNTPs，10mM）、0.5μl引物（10pmol／μl）、1μl基因組DNA（50ng）、19.45μl去離子水。PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)不同條帶大?。╞p）判定表型：GSTM1和 GSTT1（M1：215、268 bp；T1：268、480bp；M1T1：215、268、480bp；M1T1－null：268bp）；GST01－Ala140Asp（Ala／Ala：127bp；Asp／Ala：68、59、127bp；Asp／Asp：68、59 bp）；GSTP1－Ile105Val（Ile／Ile：176bp；Ile／Val：85、91、176bp；Val／Val：85、91bp）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件分析。各基因多態(tài)性在兩組間的差異采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSTs基因多態(tài)性結(jié)果分析 以GSTs基因位點(diǎn)多態(tài)性型別進(jìn)行兩組比較，顯示各基因位點(diǎn)多態(tài)性在病例和對(duì)照兩組間的差異無(wú)顯著性，P＞0.05；將基因多態(tài)型別中的雜合子與突變型合并后與野生型比較，多態(tài)性的比例在病例和對(duì)照兩組間的差異也無(wú)顯著性，P＞0.05；見(jiàn)表1。

表1 GSTs基因多態(tài)性在兩組研究對(duì)象中的比較

3 討論

黃曲霉毒素是一種真菌代謝產(chǎn)物，已報(bào)道的有：B1、B2、G1、G2、M1、M2六型，以 AFB1毒性最強(qiáng)。由黃曲霉菌與寄生曲霉菌產(chǎn)生［5］。研究顯示，黃曲霉毒素在代謝之前是無(wú)致癌性，攝入體內(nèi)后經(jīng)第一階段代謝酶代謝后的產(chǎn)物可能是其致癌作用的關(guān)鍵［5］，如：黃曲霉毒素 M1（AFM1）、黃曲霉毒素 Q1（AFQ1）、AFB1環(huán)氧化物（AFBO）等。這些親電子的代謝產(chǎn)物與細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)，如脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、蛋白質(zhì)結(jié)合并造成損害。同時(shí)，體內(nèi)的第二階段代謝酶，特別是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione S－transferase，GST），可以解毒代謝第一階段的毒性代謝產(chǎn)物，最終形成不同的終末物質(zhì)從尿液中排出。

GST基因家族已報(bào)道有7個(gè)亞族，其代謝解毒的主要機(jī)制為：將還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）與體內(nèi)疏水性的毒性代謝產(chǎn)物結(jié)合，增加其親水性以利于機(jī)體的代謝排出。在AFB1的代謝產(chǎn)物中，GSTs主要針對(duì)的是具有氧化活性的AFBO，其與細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)形成共價(jià)加合物，特別是作用于DNA后形成的8－羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8－OHdG），被認(rèn)為是AFB1誘導(dǎo)HCC發(fā)生的點(diǎn)突變起源［6］。GST基因家族存在多態(tài)性，可以影響GST酶的解毒代謝活性，從而導(dǎo)致不同個(gè)體間黃曲霉毒素代謝水平的差異，其中GSTM1和GSTT1可表現(xiàn)為特殊的缺失型或空白型（GSTM1－null、GSTT1－null），具有此類(lèi)基因型的個(gè)體在組織中不能表達(dá)GSTM1和GSTT1酶，因此也決定不同個(gè)體之間毒性物質(zhì)代謝水平的高低，最終導(dǎo)致不同個(gè)體在腫瘤發(fā)生上的差異性。但是，已發(fā)表的研究結(jié)果對(duì)GSTM1和GSTT1缺失型是否為肝癌的危險(xiǎn)因素仍存在爭(zhēng)議［7］。不同種族和地區(qū)之間GSTM1和GSTTl基因缺失率波動(dòng)范圍也較大，在亞洲人群中GSTM1和GSTT1的缺失比例范圍分別為17－75%和16－64%［7］。而本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象中GSTM1－null和GSTT1－null的比例分別為病例組42.00%和50.67%；對(duì)照組為45.33%和51.33%。在GST01－Ala140Asp和GSTP1－Ile105Val基因位點(diǎn)中，變異等位基因的出現(xiàn)的頻率分別為21.00%和45.33%。在肝癌病例和對(duì)照組間基因多態(tài)性類(lèi)型出現(xiàn)頻率基本一致，無(wú)顯著性差別。這些結(jié)果與既往的廣西和國(guó)內(nèi)人群的結(jié)果接近或一致［8－10］，但是并沒(méi)有反映出GSTM1、GSTT1的缺失，及 GST01－Ala140Asp、GSTP1－Ile105Val位點(diǎn)的多態(tài)性在肝癌病例人群和健康人群間的差別。

我們認(rèn)為這樣的結(jié)果與目前腫瘤發(fā)生研究的主流共識(shí)是相一致的，即腫瘤的發(fā)生是由遺傳基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。遺傳基因只是其中的一部分，決定了個(gè)體是否具有腫瘤易感基因。而另一方面，環(huán)境中的多種致癌因素，如化學(xué)物質(zhì)、物理因素、病毒等等都可作用于個(gè)體，并與內(nèi)部的諸多因素相互作用，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另一方面，廣西還是一個(gè)相對(duì)比較落后和蔽塞的農(nóng)業(yè)地區(qū)，人口流動(dòng)相對(duì)較少、外來(lái)人口比率偏低、具有比較穩(wěn)定的人口組成，這也是造成該地區(qū)人權(quán)基因多態(tài)性結(jié)果較為穩(wěn)定的主要原因。綜上，廣西地區(qū)肝癌的高發(fā)生率可能與該地區(qū)人群的遺傳基因關(guān)系并不密切，而是與該地區(qū)人群的黃曲霉毒素高暴露率有關(guān)［11］。

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