周曉丹 李 越 陳曉慧 張佳寧 于殿宇

超臨界體系脂肪酶膜催化合成甘油二酯的研究

周曉丹 李 越 陳曉慧 張佳寧 于殿宇

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030)

以醋酸纖維素和聚四氟乙烯為材料制備醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜，采用吸附－交聯(lián)相結合的固定化方法，用該復合膜固定化脂肪酶。并研究了在超臨界CO2狀態(tài)下，采用該固定化脂肪酶膜催化一級大豆油與甘油反應合成甘油二酯的工藝，以反應產(chǎn)物中甘油二酯的含量為指標，通過單因素與響應面法進行分析，確定最佳的工藝條件為:一級大豆油與甘油的物質(zhì)的量比為2∶1，反應溫度為64℃，時間為7 h，加酶量為3．2%，甘油含水量為1%。在此條件下，得到反應產(chǎn)物中甘油二酯的質(zhì)量分數(shù)為66．3%。

超臨界CO2 脂肪酶膜 甘油解 甘油二酯

甘油二酯(DAG)，由甘油和2個脂肪酸酯化后得到，是油脂的天然成分。近年來發(fā)現(xiàn)，膳食甘油二酯具有減少內(nèi)臟脂肪、抑制體重增加、降低血脂等生理功能［1］。甘油二酯還可作為多功能添加劑，應用于食品、藥品、化妝品等行業(yè)。

甘油二酯的獲得主要有化學法和酶法2種。早期甘油二酯的生產(chǎn)多采用化學法，但反應專一性差、產(chǎn)物得率低，而且高溫也影響產(chǎn)品的質(zhì)量［2－3］。采用酶法催化合成甘油二酯工藝的條件溫和、生產(chǎn)得率高、環(huán)保性好，是最有應用前景的生產(chǎn)工藝。然而卻未能投入工業(yè)化生產(chǎn)，是由于酶的價格昂貴，相對于化學催化劑活性較低;隨著反應的進行，酶容易失活，導致使用次數(shù)降低，成本提高［4］。而以醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜為載體的固定化脂肪酶具有化學穩(wěn)定性好、機械性能強等優(yōu)點，提高了酶在反應體系中的活性和穩(wěn)定性，有利于酶的分散、回收和再利用［5－6］。

目前，國內(nèi)外甘油二酯的制備多以酶催化法合成，該法在有機溶劑和無溶劑中反應都取得了較好進展［7］，但在超臨界體系下固定化酶法催化合成甘油二酯的相關報道較少。在超臨界狀態(tài)下二氧化碳流體具有類似于液體的密度和氣體的擴散性與黏度，可大大降低酶反應過程的傳質(zhì)阻力，提高反應速率，并且不存在溶劑殘留問題［8－9］。本試驗以大豆油和甘油為原料，對超臨界狀態(tài)下固定化脂肪酶膜催化合成甘油二酯進行研究，探討了溫度、時間、底物物質(zhì)的量、加酶量和甘油含水量對產(chǎn)物中甘油二酯含量的影響，并對其中的3個關鍵因素進一步進行響應面優(yōu)化。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

一級大豆油:黑龍江龍江福糧油有限公司提供;甘油(AR級):中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;脂肪酶Lipozyme RMIM:丹麥若維信公司;醋酸纖維素:北京惠寶聯(lián)化科技有限公司;聚四氟乙烯膜(平均孔徑0．1μm，厚度85μm):北京塑料研究所;4A型分子篩:中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司;去離子水:娃哈哈集團有限公司;乙醚、氫氧化鈉、95%乙醇、鹽酸、橄欖油等，均為分析純。

ML54電子分析天平、PHS－3C精密酸度計:梅特勒－托利多儀器有限公司;硅膠板、層析缸、手動薄層涂鋪器:上海信議儀器廠;高壓反應釜:江蘇太倉市醫(yī)療器械廠;DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:鞏義市英峪高科儀器廠;DK－2000－IIIL恒溫水浴鍋、YHW1104遠紅外恒溫干燥箱:天津北華儀器廠;LD4－2A低速離心機:北京醫(yī)用離心機廠;HPLC:Waters公司;JJ－2組織搗碎勻漿機:蘇州江東精密儀器有限公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 復合膜的制備

將15 g醋酸纖維素60℃下溶于85 g二甲基甲酰胺中得到鑄膜液。將聚四氟乙烯膜先用0．1 mol/L的NaOH溶液和0．1 mol/L的HCl溶液清洗，然后用去離子水清洗，干燥后平鋪在潔凈的玻璃板上。將醋酸纖維素鑄膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，控制厚度，在室溫下?lián)]發(fā)完成干相轉換后，浸入去離子水完成濕相轉換。12 h后用去離子水清洗，自然干燥待用。

1．2．2 脂肪酶的固定化

取若干份1 cm2的醋酸纖維素/聚四氟乙烯復合膜于三角瓶中，分別加入一定量的酶液和pH 7．5的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀緩沖液，恒溫攪拌吸附2 h(25℃，170 r/min)。再加入0．2%戊二醛進行交聯(lián)反應，反應結束后取出脂肪酶膜，用去離子水沖洗，放于干燥處待用。

1．2．3 酶活力的測定

采用橄欖油乳化法［10］。固定化酶活定義為:每平方厘米固定化酶膜在37℃，pH 7．5條件下，水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1μmol的脂肪酸所消耗的酶量為一個酶活單位，用U/cm2表示。經(jīng)測定固定化脂肪酶膜活力為17．2 U/cm2。

1．2．4 脂肪酶膜催化甘油解反應

將一級大豆油10 g，經(jīng)分子篩脫水后的甘油2 g，以一定的物質(zhì)的量比加入到高壓反應釜中，添加一定量的脂肪酶膜后快速攪拌，加入1%的水，密封高壓釜，通入CO2試漏，再用CO2置換高壓反應釜中的空氣。置換完成后，在室溫條件下充入CO2使壓力達到7．5 MPa，再將反應釜置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中加熱，調(diào)節(jié)一定的轉速，恒溫反應一段時間。反應結束后，將高壓反應釜冷卻至室溫，放出氣體，打開高壓釜，取出流體物，離心分離除去催化劑，得反應產(chǎn)物，再將反應產(chǎn)物進行液相測定，得出甘油二酯占反應產(chǎn)物的質(zhì)量分數(shù)。1．2．5 甘油二酯含量的計算

取薄層顯色效果好的反應產(chǎn)物1滴，準確稱量，用1 mL正己烷/異丙醇50∶1溶解，進樣分析。色譜條件:色譜柱:No－va－Pak 3．9 mm×150 mm液相色譜柱;主機泵:Waters515 HPLC Pump;檢測器:Waters 2410示差折光檢測器。流動相:正己烷/異丙醇為50∶1;流速:1．0 mL/min;檢測器溫度:35℃;柱箱溫度:35℃;進樣量:20μL。

各組分的計算采用面積歸一法。

式中:w為甘油二酯的質(zhì)量分數(shù);m0、m1、m2和m3分別為脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯和三酰甘油的質(zhì)量。混合甘油酯標準樣品液相圖1，在1．932 min，溶劑峰;2．182 min，三酰甘油;2．348 min，脂肪酸;2．915 min，1，3－甘油二酯;3．932 min，1，2－甘油二酯;7．940 min，甘油一酯。

圖1 混合甘油酯標準樣品液相圖

2 結果與討論

2．1 單因素試驗

2．1．1 溫度對脂肪酶膜催化甘油解反應的影響

當?shù)孜镂镔|(zhì)的量比2∶1，甘油含水量1%，時間7 h，加酶量3%時，分別選取反應溫度為55、60、65、70、75℃，考察溫度對甘油解反應中甘油二酯含量的影響。

圖2 溫度對甘油二酯含量的影響

由圖2可知，溫度從55℃升至65℃時，甘油二酯的含量逐漸上升，說明隨著溫度升高脂肪酶的催化活性部位逐漸暴露，發(fā)揮出較強的活力。當溫度為65℃時，脂肪酶的催化活性達到極值。溫度高于65℃后，甘油二酯的含量開始下降，這可能是由于較高的反應溫度，對酶的空間結構和構象產(chǎn)生較大的影響，致使脂肪酶部分失活而引起的。因此，最適溫度為65℃。

2．1．2 時間對脂肪酶膜催化甘油解反應的影響

當?shù)孜镂镔|(zhì)的量比2∶1，甘油含水量1%，溫度65℃，加酶量3%時，分別選取反應時間為5、6、7、8、9 h，考察時間對甘油解反應中甘油二酯含量的影響。

圖3 時間對甘油二酯含量的影響

由圖3可知:隨著反應時間的延長，甘油二酯的含量不斷提高，當時間達到7 h后上升趨勢并不顯著，這是因為隨著反應時間的延長，底物濃度和酶活力開始下降，甘油二酯含量的增加趨于平緩，體系基本達到平衡。另外，時間過長也會影響經(jīng)濟效益。因此，最適時間為7 h。

2．1．3 底物物質(zhì)的量比對脂肪酶膜催化甘油解反應的影響

當甘油含水量1%，溫度65℃，時間7 h，加酶量3%時，分別選取底物物質(zhì)的量比為1∶1、1．5∶1、2∶1、2．5∶1、3∶1，考察底物比對甘油解反應中甘油二酯含量的影響。

圖4 底物物質(zhì)的量比對甘油二酯含量的影響

由圖4可知:甘油二酯的含量隨著底物物質(zhì)的量比的增加而逐漸上升，并在底物物質(zhì)的量比為2∶1時達到最大，而后開始下降。這是因為反應達到平衡后產(chǎn)物的組成與底物比有關，底物比的增加，有利于副產(chǎn)物三酰甘油和甘油一酯的生成，從而使甘油二酯的含量降低［11］。因此，最適的底物物質(zhì)的量比為2∶1。

2．1．4 加酶量對脂肪酶膜催化甘油解反應的影響

當?shù)孜镂镔|(zhì)的量比2∶1，甘油含水量1%，溫度65℃，時間7 h時，分別選取加酶量為2．0%、2．5%、3．0%、3．5%、4．0%，考察加酶量對甘油解反應中甘油二酯含量的影響。

圖5 加酶量對甘油二酯含量的影響

由圖5可知:隨著酶用量的增加甘油二酯的含量也隨之提高，但當加酶量達到3%以上時，甘油二酯含量的增加趨勢并不明顯。這是因為酶用量的變化與反應速度密切相關，酶量增加，甘油解速度加快，但過多的酶會使體系形成少量糊狀物，導致分離困難，在實際生產(chǎn)中，也會導致生產(chǎn)成本增加。因此，最適的加酶量為3%。

2．1．5 甘油含水量對脂肪酶膜催化甘油解反應的影響

當?shù)孜镂镔|(zhì)的量比2∶1，加酶量3%，溫度65℃，時間7 h時，分別選取甘油含水量0%、1%、2%、3%、4%，考察甘油含水量對甘油解反應中甘油二酯含量的影響。

圖6 甘油含水量對甘油二酯含量的影響

由圖6可知:甘油含水量為1%時，甘油二酯的含量最高。之后隨著含水量增加，甘油二酯的含量呈下降趨勢，說明適宜的水分含量是維持酶活力所必須的，但當超過一定量后，酶的酯化活力會大大降低，而表現(xiàn)為較高的水解活力［12］。因此，最適的甘油含水量為1%。

2．2 超臨界體系脂肪酶膜催化甘油解反應條件的優(yōu)化

2．2．1 回歸方程的建立與分析

通過對單因素試驗結果進行分析后，選擇對底物物質(zhì)的量比、加酶量和反應溫度這3個關鍵因素進行進一步考察。確定底物物質(zhì)的量比為2∶1，加酶量3%，溫度65℃，在此基礎上采用中心組合設計(Box－Benhnken)，以底物比(A)、加酶量(B)和溫度(C)為自變量，甘油二酯的質(zhì)量分數(shù)(R1)為響應值設計響應面試驗。自變量因素水平編碼見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 因素水平編碼表

表2 響應面設計及試驗結果

通過對數(shù)據(jù)進行擬合，得到甘油二酯的質(zhì)量分數(shù)(R1)對自變量底物比(A)、加酶量(B)和溫度(C)的回歸方程為:

運用Design Expert 7．0．0軟件對試驗結果進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著(P＜0．000 1)失擬項不顯著(P＞0．05)，表中的B、C、A2、B2和C2為顯著影響因素，并且該模型R2=98．22%，R2Adj=95．92%，說明模型與試驗擬合良好，可以用于該反應的理論推測。

表3 方差分析結果

2．2．2 底物物質(zhì)的量比和加酶量對甘油二酯含量的影響

將甘油解反應中的溫度固定在0水平上，可以得到底物物質(zhì)的量比和加酶量交互作用對甘油二酯含量的影響。由圖7可知，甘油二酯含量的極值出現(xiàn)在試驗范圍內(nèi)，在底物物質(zhì)的量比約為2∶1，加酶量為3%～3．5%之間，甘油二酯的質(zhì)量分數(shù)在65%以上。

圖7 底物物質(zhì)的量比和加酶量對甘油二酯含量的影響

2．2．3 底物物質(zhì)的量比和溫度對甘油二酯含量的影響

將甘油解反應模型中的加酶量固定在0水平上，可以得到底物物質(zhì)的量比和溫度交互作用對甘油二酯含量的影響。由圖8可知，甘油二酯含量的極值出現(xiàn)在試驗范圍內(nèi)，在底物物質(zhì)的量比約為2∶1，反應溫度為62．5～65℃時，甘油二酯的質(zhì)量分數(shù)在65%以上。

圖8 底物物質(zhì)的量比和溫度對甘油二酯含量的影響

2．2．4 加酶量和溫度對甘油二酯含量的影響

將甘油解反應模型中的底物物質(zhì)的量比固定在0水平上，可以得到加酶量與溫度交互作用對甘油二酯含量的影響。由圖9可知，甘油二酯含量的極值出現(xiàn)在試驗范圍內(nèi)，在加酶量為3%～3．5%之間，反應溫度為62．5～65℃時，甘油二酯的質(zhì)量分數(shù)在65%以上。

圖9 加酶量和溫度對甘油二酯含量的影響

應用響應面優(yōu)化分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優(yōu)響應結果見表4。

表4 響應面尋優(yōu)結果

為檢驗響應面分析法所得結果的可靠性，按照上述整理值進行試驗，得到超臨界CO2體系固定化脂肪酶膜催化合成甘油二酯的質(zhì)量分數(shù)為66．3%。預測值與試驗值之間的良好擬合性證實了模型的有效性。表明所得的回歸方程可以很好的反映底物摩爾比、加酶量、溫度與甘油二酯含量的關系。應用此方法優(yōu)化的工藝參數(shù)準確可靠，在實踐中具有可行性。

3 結論

本研究確定了在超臨界CO2體系中以一級大豆油和甘油為原料，以固定化脂肪酶膜催化合成甘油二酯的工藝是可行的。通過單因素與響應面優(yōu)化試驗，確定最佳的工藝條件為:底物物質(zhì)的量比為2∶1，反應溫度64℃，時間7 h，加酶量3．2%，甘油含水量1%。最終得到反應產(chǎn)物中甘油二酯的質(zhì)量分數(shù)為66．3%。另外，固定化脂肪酶膜提高了酶在反應體系中的穩(wěn)定性，有利于酶的分散、回收和再利用，為大規(guī)模生產(chǎn)甘油二酯的推廣提供了參考依據(jù)。

［1］Takase H．Metabolism of diacylglycerol in humans［J］．Asia Pac J Clin Nutr，2007，16(Suppl1):398－403

［2］Noureddini H，Medikonduru V．Glycerlysis of fat and methyl esters［J］．J Am Oil Chem Soc，1997，74(4):419－425

［3］Corma A，Iborra S．Catalysis for the production of fine chemicals:production of food emulsifier monoglycerides，by glycerolysis of fats with solid base catalystls［J］．J Catal，1998，173(48):315－321

［4］Rosu R，Yasui，Iwasakiy Y，et al．Enzymatic synthesis of symmetrical 1，3－diacylglycerols by direct esterification of glycerol in solvent－free system［J］．J Am Oil Chem Soc，1999，76(5):839－843

［5］彭立鳳，劉新喜．棉織物上SESA活化法固定化脂肪酶工藝的研究［J］．食品工業(yè)科技，2001，22(2):30－33

［6］楊昌英，潘家榮，鐘珩，等．醋酸纖維素固定化脂肪酶催化豬油合成單甘酯［J］．湖北化工，2002，(6):20－21

［7］孟祥河．功能性甘油二酯的酶促酯化合成及其減肥功能的研究［D］．無錫:江南大學，2004

［8］趙成．祺超臨界流體及其應用［J］．鄭州糧食學院學報，1990，2(1):88－95

［9］王丹蕊，許浹，石階平．以超臨界CO2為介質(zhì)利用固定化脂肪酶進行酶促水解反應表觀動力學的研究初探［J］．北京石油化工學院學報，2003，11(1):40－43

［10］Watanabe N，Yasuhide O T A，Yasuji M．Isolation and identification of alkaline lipase producing microorganisms，cultural conditions and some properties of crude enzymes［J］．Agric Biol Chem，1997，41(8):1353－1358

［11］李相，劉云，楊江科．基于響應面設計脂肪酶Novo435催化合成甘油二酯的工藝優(yōu)化［J］．生物加工過程，2009，7(5):13－16

［12］程波．1，3甘油二酯的制備及功能研究［D］．濟南:山東師范大學，2007．

Study on the Preparation of Diacylglycerol by Lipase Membrane Catalyzed in Supercritical System

Zhou Xiaodan Li Yue Chen Xiaohui Zhang Jianing Yu Dianyu
(College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030)

CA－PTFE composite membranes were prepared by cellulose acetate(CA)and polytetrafluoroethylene(PTFE)with absorbing－crosslinking method．The CA－PTFE composite membrane was used for immobilizing lipase．The preparation of diacylglycerol by lipase Immobilized on membrane was catalyzed in Supercritical CO2system，this response was synthesized from first grade soybean oil and glycerin．According to the percentage composition of diacylglycerol，though the single factor and response surface，the optimum conditions were determine as follows:first grade soybean oil and glycerin molar ratio 2∶1，reaction temperature 64℃ ，time 7 h，the quantity of enzyme 3．2%，water content of glycerol 1%．Under these conditions，the content of diacylglycerol was 66．3%in the products．

supercritical CO2，lipase membrane，glycerolysis，diacylglycerol

TS229

A

1003－0174(2012)05－0050－06

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(11551064)

2011－08－27

周曉丹，女，1987年出生，碩士，糧食、油脂及植物蛋白工程

于殿宇，男，1964年出生，教授，博士，大豆油脂加工技術