丁 燦 郎南軍 林位夫

12個(gè)新引進(jìn)油棕品種遺傳多樣性研究

丁 燦1，2郎南軍3林位夫4，5

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院1，昆明 650201)
(北京林業(yè)大學(xué)2，北京 1000834)
(云南省林業(yè)科學(xué)院3，昆明 650204)
(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所4，儋州 571737)
(農(nóng)業(yè)部熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室5，儋州 571737)

為研究油棕新品種的遺傳多樣性，用ISSR分子標(biāo)記方法對海南的12個(gè)油棕新品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明:22個(gè)引物用于12個(gè)油棕新品種、48個(gè)單株材料的擴(kuò)增，共擴(kuò)增出185個(gè)位點(diǎn)，其多態(tài)位點(diǎn)百分率48．6%。不同品種的Gst值為0．5445，即54．45%的變異存在于品種間，45．55%的變異存在于品種內(nèi)，說明遺傳變異主要存在于品種間。據(jù)Nei－Li相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA分析，12個(gè)油棕品種分別聚為4個(gè)組:RY1號和RY9號品種各單獨(dú)為一組，RY2、RY3、RY4、RY5、RY6、RY7、RY8號品種為一組，RY10、RY11、RY12品種為一組。

油棕種質(zhì) 遺傳多樣性 ISSR

油棕(Elaeis guineensis Jacq．)屬棕櫚科油棕屬，是多年生木本油料作物，起源于非洲［1］。由于油棕果實(shí)含油量高以及單位面積產(chǎn)油量大而被譽(yù)稱為“世界油王”。

油棕是重要的油料作物和能源作物。棕櫚油在我國蘊(yùn)含著巨大的消費(fèi)市場:一方面，我國目前人均常年食用油消費(fèi)量為11．5 kg，不及世界人均消費(fèi)量15 kg(發(fā)達(dá)國家為40 kg，美國則為50 kg)［2］，隨著我國人口的增長和生活水平的提高，可見我國食用油消費(fèi)增長空間還很大;另一方面，由于全球性的能源危機(jī)日見明顯，加之由于大量使用石化能源造成的環(huán)境污染日益嚴(yán)重，因而對石油替代品之一的生物柴油將有巨大的需求，而棕櫚油是生物柴油生產(chǎn)中最有競爭力的原料，其潛在的市場不言而喻。

我國對棕油的需求量日益增長，目前國內(nèi)棕油全部依賴于進(jìn)口，因此發(fā)展油棕生產(chǎn)有重要的意義。為了發(fā)展油棕生產(chǎn)，我國曾兩次較大規(guī)模引種，后來主要因?yàn)槠贩N的適應(yīng)性不強(qiáng)及經(jīng)營管理不當(dāng)?shù)榷喾矫娴脑蚨　＿m應(yīng)性不強(qiáng)具體表現(xiàn)為花序敗育、結(jié)果甚少、產(chǎn)量很低，但也有部分個(gè)體植株表現(xiàn)較好。例如在南濱農(nóng)場適應(yīng)性較強(qiáng)的日里油棕單株年平均產(chǎn)果穗超過0．0965 t(193斤)。這些適應(yīng)性強(qiáng)的單株都比它的群體平均值高產(chǎn)75%～134%［3］。我國植棕區(qū)地處熱帶北緣，因此，選育適合我國植棕環(huán)境的油棕種質(zhì)材料是發(fā)展我國油棕生產(chǎn)的關(guān)鍵。

與其他大多數(shù)的作物相比，現(xiàn)有的油棕品種的遺傳基礎(chǔ)很狹窄［4－6］。為了拓寬油棕育種的遺傳基礎(chǔ)，現(xiàn)在世界許多種植油棕的國家如馬來西亞、肯尼亞、巴西、哥斯達(dá)黎加、尼日利亞等［7－12］都在進(jìn)行油棕種質(zhì)資源的收集、鑒定、評價(jià)和品種改良等方面的研究，并選育出許多適宜當(dāng)?shù)厣L的優(yōu)良品種。

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院(簡稱熱農(nóng)科院)從國外新引進(jìn)了一批油棕新品種，經(jīng)過幾年的試種結(jié)果表明一些品種或單株表現(xiàn)良好，為我國發(fā)展油棕生產(chǎn)帶來了希望。本研究旨在對這些種質(zhì)材料(品種)從分子水平上進(jìn)行遺傳多樣性的分析研究，可為我國油棕種質(zhì)資源的科學(xué)收集、有效保護(hù)、鑒定評價(jià)和區(qū)劃種植提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

海南省2000年新選育油棕不同種質(zhì)材料的取樣(共12個(gè)品種，代號分別為RY1～RY12):(1)每個(gè)品種隨機(jī)選取15～20個(gè)個(gè)體，用于代表該品種:每個(gè)個(gè)體均采集健康、幼嫩葉片保濕并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室清洗涼干，分別將葉片剪碎后等量均勻的混合起來提取的總DNA代表該品種。在每個(gè)品種內(nèi)隨機(jī)選取4個(gè)單株，用于代表單株:每個(gè)單株均采集健康、幼嫩的葉片分單株做好標(biāo)記，提取各單株的DNA(共48個(gè)單株)。具體情況見表1。

表1 熱農(nóng)科院(CATAS)12個(gè)品種新油棕種質(zhì)的48個(gè)單株序號

1．2 DNA提取、引物篩選、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測

采用改良的CTAB法提取油棕葉片總DNA［13］。

利用加拿大哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia，UBC)所設(shè)計(jì)的60個(gè)引物在部分模板中進(jìn)行篩選，篩選引物遵守如下原則:①產(chǎn)生的DNA帶清晰可辨;②在分析的樣品之間有較高的多態(tài)性;③產(chǎn)生多態(tài)性DNA帶譜具有重復(fù)性。本試驗(yàn)從供試的引物中，篩選出能擴(kuò)增出多態(tài)性的引物23個(gè)用于樣品的進(jìn)一步分析。

先通過一定的摸索試驗(yàn)，最終確定用于油棕的各個(gè)組分的ISSR最佳反應(yīng)體系。本試驗(yàn)所采用的優(yōu)化反應(yīng)體系總體積為15μL，各個(gè)組分的具體用量如下:MgCl2(25 mmol/L)+Buffer(10 X)2．25μL、dNTP(10 mmol/L)0．3μL、Taq酶(5 U/μL)0．15 μL、引物(0．4μmol/μL)1．0μL、模板DNA(50 ng/μL)1．0μL、ddH2O(超純水)10．3μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min(從第2步到第4步，35個(gè)循環(huán))，72℃保溫10 min，4℃保溫。

特征點(diǎn)識別出后需計(jì)算特征值，接著對這些特征值與袖帶充氣式電子血壓計(jì)測量的SBP和DBP分別進(jìn)行相關(guān)性分析，并選擇相關(guān)性比較大的特征值作為回歸變量。再接著將這些回歸變量分別與SBP和DBP進(jìn)行線性回歸分析，建立血壓與這些特征值之間的回歸方程。

采用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。在PCR產(chǎn)物中加入2μL溴酚藍(lán)染色后，取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用DL2000 DNA mark作對照，在1×TAE緩沖液中電泳，恒壓電泳為4 V/cm，1．5～2 h后，在UVIpro凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并照相。

1．3 ISSR數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析方法

每個(gè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離譜帶在某一位點(diǎn)上按有或無記錄，存在時(shí)賦值為“1”，無帶的記為“0”。將每個(gè)引物對所有樣品的讀帶記錄結(jié)果形成“0－1”矩陣。用NTSYS－pc version 2．1計(jì)算Jaccard＇s相似系數(shù)，在此基礎(chǔ)上用非加權(quán)組平均聚類法(unweighted pair－group method with arithmetic average，UPGMA)進(jìn)行聚類分析，繪制親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 12個(gè)品種內(nèi)不同單株間的遺傳多樣性研究

2．1．1 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

用22個(gè)ISSR引物對12個(gè)品種內(nèi)(每品種4個(gè)單株)共48個(gè)單株DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見表2。

表2 22個(gè)ISSR引物及擴(kuò)增結(jié)果

從表2中可以看出，22個(gè)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)目從4條至14條不等，共擴(kuò)增出185條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出條帶為8．4條。在所有的引物擴(kuò)增結(jié)果中多態(tài)位點(diǎn)百分率最多的是引物UBC812(100%)，最少的是引物UBC856(16．7%)。所有引物共擴(kuò)增出90個(gè)具有多態(tài)性的位點(diǎn)，占48．6%。

圖1 引物UBC811對48個(gè)單株擴(kuò)增的ISSR圖譜

2．1．2 12個(gè)品種內(nèi)不同單株間的聚類分析

根據(jù)各單株之間的相似系數(shù)，用POPGENE32統(tǒng)計(jì)軟件對48個(gè)單株進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，所有12個(gè)品種48個(gè)單株的相似系數(shù)都比較高(在0．85～0．98之間)，若在相似系數(shù)為0．897處劃線，12個(gè)品種的48個(gè)單株材料被聚為11類:品種RY1中的1、4單株為一類;品種RY2～RY8的大部分單株為一類;品種RY9中的34、35單株為一類;品種RY10～RY12中的大部分單株為一類;23、24單株為一類;36、42、38、46、8、33單株各為一類。

圖2 12個(gè)品種內(nèi)48個(gè)單株間的非加權(quán)組平均法聚類圖

因?yàn)橛妥厥羌扔凶曰ㄊ诜?，又有異花授粉的常異花授粉植物，用種子進(jìn)行有性繁殖的各個(gè)單株之間存在一定的變異，因此，同一品種的4個(gè)單株并未完全聚合在一起，說明同一品種內(nèi)有的單株之間存在著明顯的差異，在進(jìn)行雜交育種選擇親本時(shí)，不應(yīng)局限在品種之間進(jìn)行，也可以在品種內(nèi)的不同單株之間進(jìn)行選擇。

另外，從圖2還可以看出，第29、30號單株以及第14、18、19單株的遺傳相似系數(shù)極高(在0．98以上)，說明第14號單株(屬于品種RY4)在品種內(nèi)的差異大于品種間的差異。同時(shí)也表明同一品種內(nèi)也有遺傳相似度極高的單株(如品種RY5的第18、19號單株以及品種YR8的第29、30號單株)。

2．2 12個(gè)品種間的遺傳多樣性研究

2．2．1 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

用22個(gè)引物共檢測到185個(gè)位點(diǎn)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出8．41個(gè)位點(diǎn)，結(jié)果見表3。從表3中可以看出，品種RY9具有多態(tài)性的位點(diǎn)數(shù)最多(36個(gè))，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為19．46%;品種RY5多態(tài)位點(diǎn)數(shù)最少(12個(gè))，多態(tài)位點(diǎn)百分率僅為6．49%，平均為13．02%。Nei’s基因多樣性指數(shù)H為0．024 8～0．083 8;Shannon信息多樣性指數(shù)I為0．036 6～0．118 7。

表3 12個(gè)品種油棕22個(gè)引物的ISSR多態(tài)位點(diǎn)比率及H、I指數(shù)

根據(jù)Nei指數(shù)計(jì)算油棕各品種的遺傳分化值，結(jié)果見表4。由表4中的分析結(jié)果表明12個(gè)品種油棕總的基因多樣性Ht為0．123 1，其中品種內(nèi)的基因多樣性Hs為0．056 1，品種間的基因多樣性Ds為0．067 0，品種間的遺傳分化系數(shù)Gst為0．544 5，表明有54．45%的遺傳變異存在于材料(各品種)之間，45．55%的遺傳變異存在于材料(各品種)之內(nèi)，即遺傳變異主要存在于品種間。各品種間的基因流Nm為0．418 3，小于1，表明品種間基因交流有限。

表4 12個(gè)品種油棕的遺傳分化(由Nei指數(shù)估算)

2．2．2 12個(gè)品種間的遺傳一致度、遺傳距離分析

通過電泳分析獲得了等位基因頻率或基因型頻率以后，根據(jù)這些數(shù)據(jù)可以用來測量材料間的遺傳學(xué)關(guān)系，從不同材料間所表現(xiàn)的等位基因頻率或基因型頻率相同的方面來講，叫“遺傳一致度”(genetic identity)(I)或“遺傳相似度”(genetic similarity)，從它們所表現(xiàn)出不同的方面來講，叫“遺傳距離”(genetic distance)［14］。兩個(gè)親緣關(guān)系越近的居群或種類，在所有位點(diǎn)上的所有等位基因頻率越相近，遺傳相似性系數(shù)越接近1，而遺傳距離越接近于0;兩個(gè)親緣關(guān)系越遠(yuǎn)的種類，在所有位點(diǎn)上的所有等位基因頻率差別越大，遺傳相似性系數(shù)越接近0，而遺傳距離越接近無限大［15］。

由遺傳一致度(表5，上三角值)，反映出各品種油棕間的關(guān)系，遺傳一致度最高的是品種RY4和RY5(0．990 7)，最低的是品種RY1和RY10(0．896 3)。從遺傳距離(表5，下三角)上看，品種RY4和RY5的遺傳距離最小(0．009 3)，品種RY1和RY10的遺傳距離最大(0．109 5)。

2．2．3 12個(gè)品種間的聚類分析

圖3 12個(gè)品種油棕的非加權(quán)組平均法聚類圖

用POPGENE32統(tǒng)計(jì)軟件對表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，其結(jié)果如圖3所示。從各品種間的UPGMA聚類圖上可以更清楚的反映出來，品種RY4和RY5的遺傳距離最小，首先聚為一類，表明它們有較近的親緣關(guān)系。以坐標(biāo)尺8處劃線，12個(gè)油棕品種根據(jù)其遺傳差異可分為4個(gè)類型組:品種RY1和RY9各單獨(dú)為一組，品種RY2、RY3、RY4、RY5、RY6、RY7、RY8為一組，品種RY10、RY11、RY12品種為一組。此結(jié)果與圖3的結(jié)果基本一致。

3 討論

研究結(jié)果表明，油棕品種內(nèi)有45．55%的變異存在于品種內(nèi)部，說明品種內(nèi)不同單株間的差異大，以后在進(jìn)行品種推廣之前，要先對各品種的單株做遺傳多樣性分析，可以把同一品種內(nèi)親緣關(guān)系差異較大的個(gè)體鑒定出來，可對其進(jìn)行其他方面的研究，但不能用這些個(gè)體植株來代表該品種。即利用分子標(biāo)記技術(shù)在油棕種質(zhì)早期的研究中就可對其親緣關(guān)系進(jìn)行快速鑒定，為以后選擇親本材料提供一定的依據(jù)。

另外，熱農(nóng)科院12個(gè)品種內(nèi)48個(gè)不同單株間的聚類結(jié)果表明，部分品種內(nèi)的單株遺傳距離較遠(yuǎn)而自成一類，這是否與每個(gè)品種所選擇的單株數(shù)量偏少(4株)或所用引物數(shù)量不夠多有關(guān)，有待于今后進(jìn)一步研究。

研究結(jié)果表明，油棕不僅品種間存在著豐富的遺傳變異，而且品種內(nèi)的遺傳分化也十分明顯，這無疑拓寬了在油棕育種工作中可利用的油棕遺傳基礎(chǔ)。原來引進(jìn)的部分油棕品種存在適應(yīng)性不強(qiáng)，導(dǎo)致花序敗育等現(xiàn)象，這也是當(dāng)年我國海南、云南等地區(qū)大規(guī)模發(fā)展油棕種植而失敗的一個(gè)主要原因之一。為進(jìn)一步拓寬我國油棕種質(zhì)的遺傳多樣性，有選擇性的從國外引進(jìn)新油棕種質(zhì)，同時(shí)加強(qiáng)各地、各品種油棕種質(zhì)的交叉利用，進(jìn)一步發(fā)掘新油棕種質(zhì)及原有油棕種質(zhì)中的優(yōu)良單株，是拓寬油棕遺傳基礎(chǔ)的途徑之一，也是未來培育油棕良種和發(fā)展油棕生產(chǎn)的潛力所在。引進(jìn)的油棕種質(zhì)，可對其進(jìn)行長期的農(nóng)藝性狀觀測與抗逆性方面的研究，并且對于各類型聚類中單獨(dú)一個(gè)樣品自成一類的油棕種質(zhì)，也可對其進(jìn)行深入研究和鑒定，以期發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性強(qiáng)、農(nóng)藝性狀較好、尤其是產(chǎn)量高的油棕新種質(zhì)，為育種及生產(chǎn)服務(wù)。

表5 12個(gè)品種間的遺傳一致度(上三角)和遺傳距離(下三角)

4 結(jié)論

對熱農(nóng)科院12個(gè)品種油棕共48個(gè)單株進(jìn)行擴(kuò)增，22個(gè)引物共擴(kuò)增出185個(gè)位點(diǎn)，其中具有多態(tài)性的位點(diǎn)有90個(gè)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出8．4條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小在250～1 500 bp之間。具有多態(tài)性的位點(diǎn)共有90個(gè)，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為48．6%。對其遺傳多樣性研究結(jié)果表明，品種間的遺傳多樣性為54．45%，而品種內(nèi)的遺傳多樣性為45．55%，說明遺傳變異主要存在于品種間。

熱農(nóng)科院12個(gè)油棕品種根據(jù)其遺傳差異可分為4個(gè)組:RY1號和RY9號品種各單獨(dú)為一組，RY2、RY3、RY4、RY5、RY6、RY7、RY8號品種為一組，RY10、RY11、RY12品種為一組。

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Study on Genetic Diversity of 12 Oil Palm Varieties Introduced Newly

Ding Can1，2Lang Nanjun3Lin Weifu4，5
(School of Tobacco Sciences，Yunnan Agricultural University1，Kunming 650201)
(Beijing Forestry University2，Beijing 1000834)
(Yunnan Academy of Forestry3，Kunming 650204)
(Rubber Research Institute4，CATAS，Danzhou 571737)
(Ministry of Agriculture Key Laboratory for Tropical Crops Physiology5，Danzhou 571737)

To study the genetic diversity of new varieties of oil palm，Inter Simple Sequence Repeat(ISSR)technique was used to assess the genetic diversity of 12 new oil palm varieties which came from Hainan．The results showed:A total number of 185 bands were generated using 22 ISSR primers for 48 accessions，among which 48．6%of the total bands was polymorphic．The Gst of oil palm varieties was 0．5445，indicating that most of the diversity(54．45%)was detected among varieties，while fraction(45．55%)within variety in generally．

The results of cluster analysis based on Nei－Li coefficient revealed that these 12 oil palm varieties were divided into four groups．Varieties RY1 and RY9 took its owned group respectively;Varieties RY2，RY3，RY4，RY5，RY6，RY7 and RY8 were assembled in the same group and Varieties RY10，RY11 and RY12 in the other group．

oil palm germplasm，genetic diversity，ISSR

S792．91

A

1003－0174(2012)05－0060－06

948計(jì)劃(2009－Z17)

2011－05－31

丁燦，男，1968年出生，講師，博士，作物栽培

林位夫，男，1955年出生，研究員，博士研究生導(dǎo)師，熱帶作物栽培學(xué)與耕作學(xué)、生態(tài)學(xué)