李 爽，彭曉芝，廖鵬程，陳樹和，劉焱文

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥化學(xué)省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430061）

空心蓮子草[Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb]為莧科（Amaranthaceae）蓮子草屬（Alternanthera）多年生宿根草本植物，植物資源極為豐富。該中藥及其注射劑曾收載于1977年版《中國藥典》[1]。空心蓮子草具有清熱解毒、涼血利尿的功效[1]，用于治療流行性出血熱、流行性感冒等病毒性疾患[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，空心蓮子草提取物具有抗流行性出血熱病毒、流感病毒、乙肝病毒、狂犬病毒、皰疹病毒等多種病毒的作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)室前期對空心蓮子草抗病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中分離和鑒定了86種化合物，并篩選出22種化合物具有抗病毒生物活性，采用大孔樹脂中藥現(xiàn)代化純化技術(shù)提取了該中藥的有效部位提取物。為了驗(yàn)證空心蓮子草有效部位提取物的抗病毒生物活性，本實(shí)驗(yàn)對該提取物抗H3N2流感病毒的生物活性進(jìn)行了研究，以期為其開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 空心蓮子草有效部位提取物（由本實(shí)驗(yàn)室制得），以二甲基亞砜（DMSO）溶解后再用無血清培養(yǎng)基2稀釋成相應(yīng)濃度的含藥無血清培養(yǎng)液。利巴韋林注射液（湖北潛江制藥股份有限公司，批號：1101021），用無血清培養(yǎng)基2稀釋成相應(yīng)濃度的含藥無血清培養(yǎng)液。

1.2 試劑 小牛血清（Gibco公司產(chǎn)品，批號:16010-159），DMEM（Gibco公司，批號：562979），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Amreseo公司產(chǎn)品進(jìn)口分裝，批號：0793），DMSO（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號：TZO081119），青霉素（華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號：C0808212），鏈霉素（大連美羅大藥廠產(chǎn)品，批號：65080902），胰酶（Amresco公司產(chǎn)品進(jìn)口分裝，批號：1872B82）。

1.3 細(xì)胞和病毒 幼犬腎（MDCK）細(xì)胞和甲型H3N2流感病毒均由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒學(xué)研究所提供。流感病毒H3N2在MDCK細(xì)胞上以四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT法）[5]測定的半數(shù)組組培養(yǎng)感染劑量（TCID50）為10-4，實(shí)驗(yàn)中使用的感染劑量為100 TCID50。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)基 細(xì)胞增殖培養(yǎng)基：含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，青霉素、鏈霉素含量為100μg/mL。無血清培養(yǎng)基1：含青霉素、鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基2：含青霉素、鏈霉素100 μg/mL，胰蛋白酶 2 μg/mL 的 DMEM 培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 藥物對細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 在96孔板上，每孔加入 0.1 mL，2×10-5的 MDCK 細(xì)胞，24 h待細(xì)胞長成單層后，加入用無血清培養(yǎng)基2稀釋的不同濃度的含藥無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每一藥物濃度均重復(fù)4孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對照組和溶劑對照組（DMSO-無血清培養(yǎng)基2=1∶10混合后過濾除菌）。每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化，72h后，用MTT對活細(xì)胞進(jìn)行染色[6]，讀取A570，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=A570實(shí)驗(yàn)/A570正?！?00%

2.2 藥物抗病毒作用 空心蓮子草有效部位提取物和利巴韋林注射液對甲型H3N2流感病毒的作用各分為3組。Ⅰ組（藥物阻斷病毒吸附、穿入組）：先將不同濃度藥物加入到MDCK細(xì)胞上作用6 h后，棄去藥液,加入經(jīng)15 μg/mL胰酶預(yù)處理后的100 TCID50病毒液作用2 h，再更換成無血清培養(yǎng)基2。Ⅱ組（藥物直接殺傷病毒組）：100 TCID50病毒液與不同濃度藥物4℃作用6 h后，再用15 μg/mL胰酶預(yù)處理,再加入到MDCK細(xì)胞上吸附2 h,最后更換為無血清培養(yǎng)基2。Ⅲ組（藥物抗病毒生物合成組）：先將100 TCID50病毒液用15 μg/mL胰酶預(yù)處理后,加入到MDCK細(xì)胞上吸附2 h，再更換為不同濃度含藥維持液。

Ⅰ～Ⅲ組每個(gè)濃度重復(fù)4孔，同時(shí)設(shè)病毒對照組、正常細(xì)胞對照組和溶劑對照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)，每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化。待病毒對照組細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）[7]達(dá)80%以上，且細(xì)胞對照組正常時(shí)，用MTT對活細(xì)胞染色，讀取A570吸光值，按下列公式計(jì)算藥物對病毒的抑制率[8]：

病毒抑制率（%）＝（藥物處理組A值-病毒對照組A值）/（正常細(xì)胞對照組A值-病毒對照組A值）×100%

2.3 數(shù)據(jù)處理 各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，然后分別計(jì)算各數(shù)據(jù)平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0以Probit回歸計(jì)算藥物半數(shù)毒性濃度（TC50）與半數(shù)有效濃度（IC50）。以TI作為藥物抗H3N2作用的評價(jià)指標(biāo)，TI=TC50/IC50[9]。

3 結(jié)果

3.1 藥物對MDCK細(xì)胞的毒性作用 空心蓮子草有效部位提取物和利巴韋林注射液對MDCK細(xì)胞的毒性作用表現(xiàn)為：細(xì)胞折光性增加、細(xì)胞變圓、破碎、脫壁，且藥物對細(xì)胞的毒性作用在一定范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率降低。計(jì)算空心蓮子草有效部位提取物和利巴韋林注射液TC50分別為（115.39±1.26）μg/mL，（454.012±10.03）μg/mL。溶劑對照組顯示DMSO小于1%時(shí)細(xì)胞存活率未受影響，用于藥效學(xué)的藥物混合液中DMSO最高的僅有0.2%。

3.2 藥物對甲型H3N2流感病毒的抗病毒作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空心蓮子草有效部位提取物和利巴韋林注射液的抗病毒生物合成組均能明顯減輕甲型H3N2流感病毒感染MDCK細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）程度，且呈明顯量-效關(guān)系。利巴韋林尚具有一定程度阻斷病毒吸附穿入和直接殺傷病毒的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

表1 空心蓮子草有效部位提取物抗病毒生物合成組（n=3，±s）Tab.1 The antiviral biosynthesis group of Alternanthera Philoxeroides effective fractions extracts（n=3，±s）

表1 空心蓮子草有效部位提取物抗病毒生物合成組（n=3，±s）Tab.1 The antiviral biosynthesis group of Alternanthera Philoxeroides effective fractions extracts（n=3，±s）

給藥方式 藥物濃度（μg/mL）病毒抑制率（%）IC50（μg/mL）TIⅢ125.0081.08±1.4662.5068.98±1.4631.2551.09±0.7315.6337.47±1.1747.52±0.432.43±0.017.8118.98±1.103.919.97±0.92

表2 利巴韋林抗甲型H3N2流感病毒作用（n=3，±s）Tab.2 Antiviral activity of Ribavirin injection against virus A H3N2（n=3，±s）

表2 利巴韋林抗甲型H3N2流感病毒作用（n=3，±s）Tab.2 Antiviral activity of Ribavirin injection against virus A H3N2（n=3，±s）

給藥方式 藥物濃度（μg/mL）病毒抑制率（%）IC50（μg/mL）TIⅠ 1000.0086.98±0.76500.0067.88±0.73250.0046.11±0.92125.0023.11±1.72404.10±3.481.12±0.0262.5012.41±1.1031.257.66±1.10Ⅱ 1000.0083.46±1.28500.0064.60±1.10250.0044.04±0.76125.0026.03±0.76433.37±9.801.05±0.0162.5013.26±0.4231.257.78±0.92Ⅲ 125.0085.16±0.7662.5069.46±0.7631.2553.16±0.9215.6336.38±0.7644.74±1.2210.15±0.097.8119.71±1.313.907.91±0.56

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以空心蓮子草有效部位提取物為研究對象，通過MTT法測定了其對MDCK細(xì)胞的毒性，建立Probit回歸模型,計(jì)算其半數(shù)毒性濃度TC50為（115.39±1.26）μg/mL?？共《緦?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空心蓮子草有效部位提取物對流感病毒有明顯抗病毒生物合成作用，其 TI為（2.43±0.01），但其阻止流感病毒吸附與直接殺傷流感病毒的作用不明顯。因此，本研究結(jié)果闡釋了空心蓮子草有效部位提取物抗病毒的生物活性，為其開發(fā)應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1977：376-377.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（上冊）[S].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977：1470-1471.

[3]李瓊婭，范文乾，馬 卓，等.空心蓮子草化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18(2):334－335.

[4]馬 卓，李瓊婭，范文乾，等.蓮子草屬藥用植物的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2008，25（2）：1－6.

[5]孟慶楠，張浩楠，王益民.MTT法檢測銀杏葉注射液對人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，30（1）：36-37.

[6]Marina P,Sonia S,Umberto B,et al.Interference in MTT cell viability assay in activated macrophage cell line[J].Anal Biochem,2003,13(2):38-39.

[7]張艷麗，顧立剛，王慶國，等.清肺注射液不同配伍體對流感病毒增殖的影響[J].天津中醫(yī)藥，2007，24（5）：411-413.

[8]賀鳳蘭，劉 強(qiáng)，劉媛媛，等.歐意清熱解毒軟膠囊體外抗甲型H1N1 流感病毒作用[J].中國中藥雜志，2011，36（14）：1993－1996.

[9]劉 強(qiáng)，賀鳳蘭，劉媛媛，等.鹽酸阿比朵爾膠囊抗甲型H1N1流感病毒的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2011，46（2）：108－112.