龐保全

山東省菏澤市第二人民醫(yī)院，山東菏澤 274005

奧扎格雷鈉對腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞的保護作用

龐保全

山東省菏澤市第二人民醫(yī)院，山東菏澤 274005

目的探討奧扎格雷鈉對大鼠腦缺血再灌注損傷的腦保護作用。 方法 采用Longas法制備大鼠腦缺血再灌注模型，分別用奧扎格雷鈉（治療組）和0.9%氯化鈉注射液（對照組）腹腔注射。觀察大鼠腦梗死體積、神經(jīng)功能評分、細胞凋亡數(shù)和細胞凋亡率。 結(jié)果治療組比對照組大鼠腦梗死體積明顯減小，神經(jīng)凋亡數(shù)較對照組顯著減少 （P＜0.01）。 對照組神經(jīng)功能評分為（2.83±0.75）分，治療組為（1.83±0.75）分，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。 3組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 結(jié)論 奧扎格雷鈉能明顯減小腦缺血的梗死體積，減輕腦缺血再灌注后的神經(jīng)損害，具有明顯的腦保護作用。

奧扎格雷鈉；腦缺血再灌注；神經(jīng)細胞；凋亡

急性缺血性腦損傷是非常復(fù)雜的病理生理過程，主要是缺血后能量代謝障礙。缺血性腦損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受損的重要原因之一，是當前防治腦血管疾病的熱點。奧扎格雷鈉是一種特異性血栓A2（TXA2）合成酶抑制劑，能降低TXA2濃度，促進前列環(huán)素I2（PGI2）的生成，并維持二者間的平衡，還能選擇性地擴張血管，改善腦組織微循環(huán)和能量代謝，抗血小板聚集，有效地抑制血栓形成[1-3]。奧扎格雷鈉目前已廣泛用于治療缺血性腦血管病，本研究采用大鼠腦缺血再灌注病理模型，觀察奧扎格雷鈉對腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞的保護作用，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性Wistar大鼠84只，質(zhì)量210～270 g，由山東省實驗動物中心提供，隨機分為鹽水對照組（32只）、假手術(shù)組（20只）、奧扎格雷鈉治療組（32只），觀察3組僅缺血90 min（IR 0 h）和再灌注 24 h（IR 24 h）兩個時段的神經(jīng)細胞凋亡數(shù)和凋亡率。

1.2 方法

大鼠腦缺血再灌注模型制作及給藥 采用Longa Z等[4]報道的方法進行改進，術(shù)中室溫保持24℃。用大鼠大腦中動脈線栓法（MCAO）制備腦缺血再灌注大鼠模型，具體操作如下：用6%水合氯醛（0.4～0.5 mL/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉，取頸部正中切口，暴露頸總動脈，于其深處用細線穿住，分離頸內(nèi)外動脈，于頸外動脈切一小口，用插線插入至頸總動脈，并下拉，由分叉處插入頸內(nèi)動脈，然后收緊活結(jié)，松開頸總動脈夾，抽出深處的細線，縫合切口。栓塞2 h后進行長達12 h的再灌注。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈，不阻斷血流[5]。腦缺血的大鼠麻醉清醒后，具備向左側(cè)轉(zhuǎn)彎，左前肢不能伸直為研究對象。假手術(shù)組大鼠栓子插入僅9 mm。治療組大鼠，于缺血前半小時和缺血后，分別向腹腔注射奧扎格雷鈉水溶液（2 mg/kg）各一次，假手術(shù)組及對照組腦缺血大鼠，均在相同時間點，分別向腹腔注射等量的0.9%氯化鈉注射液。

1.3 觀察指標

1.3.1 神經(jīng)功能評分 0分：無神經(jīng)損傷體征；1分：提尾時不能完全伸直對側(cè)前爪；2分：行走時向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：站立時向?qū)?cè)傾斜；4分：不能行走，意識喪失。

1.3.2 細胞凋亡測定 在相應(yīng)時間點，各組大鼠于評分后，分別取5只，麻醉處死。經(jīng)枕骨大孔撐開顱骨，小心取處腦組織，迅速取出缺血邊緣區(qū)新鮮腦組織50 mg，置于5℃75%乙醇中處理，用流式細胞儀（FACS420，山東省腫瘤研究所）檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.3.3 腦梗死體積測定 在預(yù)定時間點，治療組和對照組各取6只大鼠，麻醉后斷頭處死，迅速取腦，置于冰箱中0.5 h后，在額極后，每間隔2 mm，連續(xù)取5個冠狀腦切片，將切好的腦片立刻置于37℃2%紅四氮唑磷酸緩沖液中避光，恒溫孵育30 min，染色后，經(jīng)10%多聚甲醛液固定24 h后封片，用球積分析儀系統(tǒng)進行分析，計算出梗死體積[3]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，檢測結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，組間比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦梗死體積與神經(jīng)功能評分比較

奧扎格雷鈉治療組和對照組大鼠腦組織有缺血性的梗死灶，和MCA支配區(qū)域一致，奧扎格雷鈉治療組大鼠腦梗死體積為（107.9±12.1） mm3，明顯小于對照組的（150.3±30.5） mm3（P＜0.05）。假手術(shù)組大鼠肢體無神經(jīng)損傷體征，神經(jīng)功能評分正常。對照組大鼠腦神經(jīng)功能評分為（2.83±0.75）分，奧扎格雷鈉治療組為（1.83±0.75）分，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。 見表 1。

表1 各組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能評分比較（±s）

表1 各組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能評分比較（±s）

注：“-”代表無數(shù)據(jù)

組別 腦梗死體積（mm3） 神經(jīng)功能評分（分）假手術(shù)組對照組治療組--150.3±30.5 107.9±12.1 2.83±0.75 1.83±0.75

2.2 各組神經(jīng)細胞凋亡數(shù)及凋亡率比較

在 0、24 h時，假手術(shù)組神經(jīng)細胞凋亡率分別為（3.5±1.3）%和（3.4±2.0）%；對照組為（9.2±2.2）%和（10.0±2.1）%；治療組為（6.1±1.1）%和（7.9±1.2）%。3 組神經(jīng)細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。假手術(shù)組偶見凋亡細胞；對照組0 h出現(xiàn)凋亡細胞，24 h可見大量凋亡細胞；奧扎格雷鈉治療組在缺血中心邊緣也可見凋亡細胞，與對照組比較，明顯減少（P ＜ 0.01）。見表 2。

表2 各組大鼠腦缺血神經(jīng)細胞凋亡率及凋亡數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠腦缺血神經(jīng)細胞凋亡率及凋亡數(shù)比較（±s）

組別 細胞凋亡率（%）IR 0 h IR 24 h細胞凋亡數(shù)（個/高倍鏡）IR 0 h IR 24 h假手術(shù)組對照組治療組3.5±1.3 9.2±2.2 6.1±1.1 3.4±2.0 10.0±2.1 7.9±1.2 3.1±0.9 13.6±0.8 5.4±1.2 2.1±1.2 16.7±2.1 8.7±1.6

3 討論

腦血管疾病嚴重危害著人們的身體健康，缺血性腦血管病由于存在著高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率[6-8]，嚴重危及人們的生命健康，成為亟待解決的問題之一。腦缺血再灌注會產(chǎn)生嚴重的遲發(fā)型神經(jīng)元損傷，機制尚不清楚。動物實驗[9]證明，腦缺血造成的神經(jīng)損傷是多因素的，包括缺氧和啟動神經(jīng)毒性級聯(lián)反應(yīng)。腦缺血再灌注時氧自由基尤其是超氧化陰離子過多造成組織損傷，血腦屏障破壞從而產(chǎn)生腦水腫，興奮氨基酸NMDA受體的神經(jīng)毒作用造成神經(jīng)元損傷[10-11]；后者涉及腦缺血再灌注后細胞死亡程序的激活。腦缺血再灌注損傷是一種受基因調(diào)控的自主控制性細胞死亡過程，細胞死亡中則以細胞凋亡為主。儲照虎等[12]研究提示，缺血再灌注24 h后的大鼠腦組織中，在缺血側(cè)可檢測到較多的凋亡細胞。凋亡細胞主要集中在腦缺血梗死灶的周圍半暗帶區(qū)域，缺血中心僅見少量凋亡細胞。腦缺血再灌注后，缺血周圍半暗帶區(qū)域神經(jīng)細胞的遲發(fā)性死亡方式為凋亡細胞。

腦缺血后，梗死周圍半暗帶區(qū)域微血管增生的范圍和程度直接關(guān)系到缺血區(qū)域血流的改善，影響凋亡細胞的發(fā)展和神經(jīng)細胞生理功能的回復(fù)。為了有效地挽救腦缺血周圍半暗帶區(qū)域神經(jīng)細胞，神經(jīng)保護劑的研究成為重點，其通過保護受損神經(jīng)元以及促進側(cè)支循環(huán)的建立而改善缺血癥狀。奧扎格雷鈉具有降低血液黏稠度，使血細胞稀釋或解聚的作用，使血栓的形成減少，阻止血栓進一步延長和擴展，防止缺血性半暗帶周圍的微血栓形成，具有降血脂、擴張血管、改善微循環(huán)等功能。臨床研究也已表明，奧扎格雷鈉具有很好的抗血栓形成作用，可改善血液的高凝狀態(tài)，使腦梗死區(qū)域血液供應(yīng)得到改善，從而有利于腦部側(cè)支循環(huán)的建立，使腦神經(jīng)功能得到最大程度的康復(fù)。奧扎格雷鈉為TXA2合成酶抑制劑，其對缺血腦組織的保護作用，可能與其對IL-6和TNF-α的調(diào)節(jié)有關(guān)[13]。TNF-α在缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，腦缺血再灌注后，TNF-α表達增加，與腦損傷程度呈正相關(guān)，TNF-α還可刺激IL-6分泌增加，而IL-6可抑制TNF-α的分泌，減輕炎癥反應(yīng)，參與保護腦缺血造成的神經(jīng)損傷，而研究表明，奧扎格雷鈉能抑制TNF-α的表達，間接促進IL-6的神經(jīng)保護作用，從而減輕腦損傷。本研究結(jié)果表明，奧扎格雷鈉治療組大鼠腦梗死體積小于對照組（P＜0.05），腦組織缺血改變明顯好于對照組。因此，說明奧扎格雷鈉能減輕腦缺血局部的損傷，對神經(jīng)系統(tǒng)有直接保護作用。

對大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡觀察表明，奧扎格雷鈉治療組細胞凋亡數(shù)小于對照組，可見奧扎格雷鈉具有降低腦缺血后細胞凋亡的作用，抑制腦缺血再灌注后細胞凋亡是奧扎格雷鈉對缺血腦神經(jīng)的重要保護作用。減輕腦缺血再灌注后細胞凋亡，是治療腦缺血的重要環(huán)節(jié)，奧扎格雷鈉的神經(jīng)系統(tǒng)保護作用對腦缺血的防治具有重要的臨床應(yīng)用價值。

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The protective effect of ozagrel sodium on neurocyte after cerebral ischemia reperfusion

PANG Baoquan
The Second People's Hospital of Heze City in Shandong Province,Heze 274005,China

Objective To investigate the protective effect of ozagrel sodium on brain after cerebral ischemia reperfusion in rats.Methods The Longas method was used to make cerebral ischemia reperfusion model of rats,and the rats were given intraperitoneal injection of ozagrel sodium(treatment group)and normal saline(control group)respectively.The volume of cerebral infarction,neural deficit scores,the number of cell apoptosis and the cell apoptosis rate of rats were observed.Results The volume of cerebral infarction of treatment group was significantly decreased than that of control group,and the number of cell apoptosis was significantly reduced than that of control group (P<0.01).The neural deficit scores were(2.83±0.75)points in the control group,and (1.83±0.75)points in the treatment group,there were significant differences between the two groups(P<0.05).The differences of cell apoptosis rates among the three groups were statistically significant(P<0.01).Conclusion Ozagrel sodium can obviously decrease the volume of cerebral infarction of cerebral ischemia,lighten the nerve damage after cerebral ischemia reperfusion,which has significant cerebral protection effects.

Ozagrel sodium;Cerebral ischemia reperfusion;Neurocyte;Apoptosis

R743

A

1674-4721（2012）11（c）-0012-03

2012-07-23 本文編輯：陳 ?。?/p>