蘇騰甲，朱雄偉，張佑紅，劉 芬，劉婷婷，徐智鵬，李衛(wèi)朋

（武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北武漢 430074）

一種果膠酶生產(chǎn)菌株的分離及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

蘇騰甲，朱雄偉，張佑紅*，劉 芬，劉婷婷，徐智鵬，李衛(wèi)朋

（武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北武漢 430074）

為了從自然界中尋找一種果膠酶生產(chǎn)菌株，在果膠平板上經(jīng)過篩選、復篩，分離出產(chǎn)果膠酶生產(chǎn)菌株，并將分離得到的菌株在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)、測定其酶活力，其發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH、最適溫度、最適接種量及發(fā)酵周期進行初步研究.結果表明：經(jīng)過篩選得到的產(chǎn)果膠酶菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為7.0、培養(yǎng)溫度為33℃、接種量為30%、發(fā)酵周期為56 h時，此菌株產(chǎn)酶的酶活力最高，優(yōu)化后的條件大大提高了菌株的產(chǎn)酶能力.

果膠酶生產(chǎn)菌株;純化;發(fā)酵;產(chǎn)酶條件優(yōu)化;酶活力

0引言

果膠酶是指分解果膠的一種多酶復合物，通常包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶，通過它們的聯(lián)合作用使果膠質(zhì)得以完全分解［1］.天然的果膠質(zhì)在原果膠酶作用下，轉化成水溶性的果膠;果膠被果膠甲酯水解酶催化去掉甲酯基團，生成果膠酸;果膠酸經(jīng)果膠酸水解酶類和果膠酸裂合酶類降解生成半乳糖醛酸，果膠酶廣泛應用于食品工業(yè)、飼料工業(yè)、造紙工業(yè)和紡織工業(yè)中［2］.

盡管自然界中天然果膠酶廣泛存在于動植物體內(nèi)，但其產(chǎn)量較低、難以大規(guī)模提取，所以尋求果膠酶的生產(chǎn)方法意義重大.其中，采用微生物發(fā)酵的方法，從微生物的代謝產(chǎn)物中提取果膠酶的方法，受到越來越多的關注［3］.本研究從自然界中采樣，篩選出可以產(chǎn)生果膠酶的菌株，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵產(chǎn)果膠酶，并通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，使果膠酶的產(chǎn)量得到提高.篩選得到的菌株發(fā)酵產(chǎn)生的果膠酶可以直接應用于生物脫膠技術.

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 樣品 從咸寧瑞豐苧麻有限公司3號污水處理池采集土樣.

1.1.2 試劑與儀器 果膠（美國Sigma公司生產(chǎn)），DNS，pH計，電子天平，2001型振蕩慍溫培養(yǎng)

箱，水平離心機，立式壓力蒸汽滅菌鍋，島津紫外UV－1800分光光度計.

1.1.3 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：蛋白胨質(zhì)量分數(shù)2.0%，氯化鈉質(zhì)量分數(shù)0.5%，牛肉膏質(zhì)量分數(shù)0.5%，果膠質(zhì)量分數(shù)0.5%，瓊脂質(zhì)量分數(shù)2%;選擇培養(yǎng)基A：果膠質(zhì)量分數(shù)0.5%，蛋白胨質(zhì)量分數(shù)1%，氯化鈉質(zhì)量分數(shù)0.5%，瓊脂質(zhì)量分數(shù)2%;選擇培養(yǎng)基B：磷酸氫二鉀質(zhì)量分數(shù)0.1%，硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)0.5%，硝酸鈉質(zhì)量分數(shù)3%，硫酸亞鐵質(zhì)量分數(shù)0.01%，果膠質(zhì)量分數(shù)5%，瓊脂質(zhì)量分數(shù)2%;種子培養(yǎng)基：果膠質(zhì)量分數(shù)0.5%，蛋白胨質(zhì)量分數(shù)1%，氯化鈉質(zhì)量分數(shù)0.5%;發(fā)酵培養(yǎng)基：果膠質(zhì)量分數(shù)0.5%，蛋白胨質(zhì)量分數(shù)1%，氯化鈉質(zhì)量分數(shù)0.5%.

1.2 方法

1.2.1 篩選路線 采樣土樣→富集培養(yǎng)→初篩培養(yǎng)→復篩培養(yǎng)→種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→菌種保存.

1.2.2 篩選方法 a.富集培養(yǎng)：將采集到的土樣取樣10 g，放入盛90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振蕩搖約20 min，使土樣與水充分混合，配制成土壤懸液.用一支1 mL無菌吸管吸取1 mL土壤懸液加入到9 mL無菌水的大試管中充分混勻，此為 10－1稀釋液，以此類推配制成 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6幾種稀釋度的土壤溶液.將以上的幾種稀釋度的土壤溶液，分別置于含有富集培養(yǎng)基的平板中進行培養(yǎng).35℃培養(yǎng)1～2 d，進行多次富集培養(yǎng)，篩選出生長良好的菌株［3］.

b.初篩培養(yǎng)：取在富集培養(yǎng)基生長良好的菌株，用無菌水稀釋后涂布于選擇培養(yǎng)基 A中，35℃培養(yǎng)1～2 d，選取生長良好的菌株，進行復篩培養(yǎng).

c.復篩培養(yǎng)：取在選擇性培養(yǎng)基A生長良好的菌株，用無菌水稀釋后涂布于選擇培養(yǎng)基B中，35℃培養(yǎng)1～2 d，選取生長良好的菌株，并進行多次復篩培養(yǎng)，篩選出優(yōu)良菌株.

d.種子罐培養(yǎng)：經(jīng)過復篩得到的菌株，置于250 mL搖瓶中35℃培養(yǎng)2～3 d，搖床轉速為120 r/min.種子罐培養(yǎng)的目的是使菌種量最大化，進而有足夠的菌種進行發(fā)酵罐培養(yǎng).

e.發(fā)酵罐培養(yǎng)：種子罐得到的菌種液按8%的菌種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行菌株的發(fā)酵培養(yǎng).

1.2.3 酶活力的測定 a.葡萄糖標準曲線的繪制：采用標準曲線法，配制已知濃度的標準葡萄糖溶液，用分光光度計在540 nm處測定其吸光度，以吸光度（A）為橫坐標、每毫升溶液葡萄糖毫克數(shù)（C）為縱坐標，作A與C標準曲線.

b.菌株發(fā)酵液中酶液的提?。喝∵m量發(fā)酵液置于15 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min，上清液即為酶液.

c.酶活力的測定：取一個15 mL離心管加入l% 的果膠溶液1.0 mL，50℃預熱3 min、加酶液0.2 mL、混合、50 ℃ 水解 10 min，加 DNS 試劑3 mL，混合后于沸水浴中10 min，冷卻定容至15 mL，并用等量的發(fā)酵培養(yǎng)基0.2 mL空白調(diào)零，540 nm下測定吸光度值.

酶活力E=（194/180×C×1 000）/（0.2×10）

通過測定上述發(fā)酵上清液對果膠的降解液的吸光度A，再由葡萄糖標準曲線得到標準方程，得到果膠酶分解果膠得到的半乳糖醛酸的量經(jīng)過換算得到的葡萄糖的量C.

194/180為葡萄糖換算成半乳糖醛酸的量.

在以上測定條件下，1 min水解果膠產(chǎn)生1 μg還原糖（以半乳糖醛酸計），所需酶量定義為1個酶活力單位（U）.

d.產(chǎn)酶條件的研究：將篩選得到的產(chǎn)果膠酶菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，并對其發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量和發(fā)酵周期的研究，從而可以得到使此菌株產(chǎn)果膠酶的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件.

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖量與吸光度的關系曲線：橫坐標為每毫升溶液葡萄糖毫克數(shù)（mg/mL），縱坐標為吸光度（A）.如圖1所示.

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 酶活力測定

經(jīng)搖瓶發(fā)酵得到的酶液測定其吸光度A0，相對應的半乳糖醛酸量G，經(jīng)過計算得到的酶活力E.如表1所示.

表1 酶液的吸光度A0、半乳糖醛酸量G和酶活力E Table 1 Absorbance A0，galactose uronic acid amount G，enzyme activity E of pectinase

由表1結果表明經(jīng)過篩選得到的菌株有產(chǎn)果膠酶的能力，此菌株呈梭形短桿狀，菌落邊緣光滑，為革蘭氏陰性，屬細菌類.

2.3 產(chǎn)果膠菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響 在培養(yǎng)時間48 h、培養(yǎng)溫度30℃、接種量相同的條件下，轉速為120 r/min時，測定不同發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)果膠酶的酶活力變化.由圖2可知，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0左右，即中性pH條件下，菌株產(chǎn)酶效率高.pH值可以影響發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分解離，同時也影響著酶的活性，pH過高或者過低都會影響酶的產(chǎn)量.

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of fermentation medium initial pH on enzyme producing

2.3.2 培養(yǎng)溫度對酶活力的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0、轉速12 r/min、接種量相同的情況下，培養(yǎng)48 h時，測定不同培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)果膠酶的酶活力變化，見圖3.

圖3 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of culture temperature on enzyme producing

如圖3所示，菌株培養(yǎng)溫度在33℃左右時，菌株產(chǎn)酶效率高.溫度過高或過低，都會影響酶活力，溫度影響著菌株的繁殖和酶的產(chǎn)量.

2.3.3 接種量對產(chǎn)酶的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0、培養(yǎng)溫度30℃、轉速120 r/min、培養(yǎng)48 h的條件下，控制接種量為平時的10%，20%，30%，40%，50%，60%測定菌株的產(chǎn)酶效果變化，見圖4.

圖4 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on enzyme producing

如圖4所示，接種量為平時接種量的40%時，酶活力達到最高.接種量過低，菌株的生長時間較長，酶活較低;接種量過大時，造成短時間積累大量次級代謝產(chǎn)物而影響產(chǎn)酶效果.

2.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)周期對產(chǎn)酶的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH為 7.0、培養(yǎng)溫度 30℃、轉速120 r/min、接種量相同的條件下，調(diào)節(jié)菌株發(fā)酵周期的時間，測定菌株的產(chǎn)酶效果變化.

如圖5所示，菌株的發(fā)酵周期為56 h左右時，果膠酶的酶活力達到最大.發(fā)酵周期短，酶可能沒有最大化分泌到細胞外，從而使酶活力較低;發(fā)酵周期過長時，積累大量次級代謝產(chǎn)物而影響產(chǎn)酶效果，甚至會影響已經(jīng)產(chǎn)生的酶的活性.

圖5 發(fā)酵周期對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of fermentation period on enzyme producing

3結論

通過從苧麻池的厭氧池中采樣，經(jīng)過馴化篩選，得到了一種菌株，通過研究此菌株，證明其有產(chǎn)果膠酶的能力，為革蘭氏陰性細菌;通過對菌株發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、最適溫度、最適接種量和最佳發(fā)酵周期的實驗研究.結果表明，此菌株的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0、最適培養(yǎng)溫度33℃、最適接種量為平時接種量的40%、最佳的發(fā)酵周期為56 h.

［1］ 張樹政.酶制劑工業(yè)［M］.下冊.北京：科學出版社，1984：233－236.

［2］ 王軍，黃秀琴，王潔，等.一株高產(chǎn)果膠酶菌的分離及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（36）：17902－17904.

［3］ 裘紀瑩，王未名，陳建愛，等.微生物果膠酶的研究進展［J］.中國食品添加劑，2010，1（4）：238 －241.

［4］ 沈萍，陳向東.微生物學實驗［M］.北京：高等教育出版社，2007：28－34.

［5］ 毛煒坤，張振中，王向東，等.野生苧麻微生物脫膠優(yōu)勢菌的選育及其應用［J］.紡織學報，2010，31（11）：66－72.

［6］ 張浩森，繆靜，余曉斌，等.果膠酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的研究［J］.生物學雜志，2008，25（1）：28－30.

［7］ QU Er Jun，LI Wen Jian，LIU Yun Xiao，et al.Inducing and Screening of High Producing Pectinase Aspergillus niger Strain［J］.Agricultural Science and Technology，2010，11（4）：22 －29.

［8］ Reid W W.The pectic enzymes of the fungus Byssochlamys fulva［J］.Biochem J，1952，50（3）：289 －292.

［9］ Sivakumar D，Wijeratnam W R S，Wijesundera R L C.Effect of GRAS compounds on mycelial growth，pectic enzyme activity and disease severity of postharvest pathogens on rambutan［J］.Biomedical and Life Sciences，2001，29（2）：135 －141.

［10］ Brien P，Zamani M.Production of pectic enzymes by barepatch isolates of Rhizoctonia solani AG 8［J］.Australasian Plant Pathology，2003，32（1）：65 －72.

［11］ Neate S M，Cruickshank R H，Rovira A D.Pectic enzyme patterns of Rhizoctonia solani isolates from agricultural soils in South Australia［J］.1988，90（1）：37－42.

［12］ Volpi C，Janni M，Lionetti V，et al.The Ectopic Expression of a Pectin Methyl Esterase Inhibitor Increases Pectin Methyl Esterification and Limits Fungal Diseases in Wheat［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2011，24（9）：1012 －1019.

［13］ Conde E，Moure A，Dominguez H，et al.Purified Phenolics from Hydrothermal Treatments of Biomass：Ability To Protect Sunflower Bulk Oil and Model Food Emulsions from Oxidation［J］.J Agric Food Chem，2011，59（17）：9158 －9165.

［14］ Romero-Cascales I，Ros-García J M，López-Roca J M，et al.The effect of a commercial pectolytic enzyme on grape skin cell wall degradation and colour evolution during the maceration process［J］.Food Chemistry，2012，130（3）：626 －631.

Separation of one pectinase strain and optimization for it’s production of enzymes

SU Teng-jia，ZHU Xiong-wei，ZHANG You-hong，LIU Fen，LIU Ting-ting，XU Zhi-peng，LI Wei-peng
（Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education，School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China）

A pectinase strain from the nature would was screened and rescreened on the culture dishes，and cultivated in the shake flask for fermentation.The enzyme activity of pectinase strain was also detected in the cultivation process.The initial pH value of fermentation medium，fermentation temperature，optimum innoculation amount and the fermentation period were studied preliminarily.The results show that the pectinase strain has the best enzyme activity when the initial pH value of fermentation medium is 7.0，the culture temperature is 33 ℃，the innoculation amount is 30%and fermentation period is 56 h.The optimized conditions can greatly improve the enzyme activity.

pectinase strain;purification;fermentation optimization for enzyme production;enzyme activity

Q93－33

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2012.04.004

1674-2869（2012）04-0015-04

2012-03-15

蘇騰甲（1989－），男，安徽宣城人，碩士研究生.研究方向：生物工程與技術.

指導老師：張佑紅，男，教授，博士，博士研究生導師.研究方向：生物技術.*通信聯(lián)系人

張 瑞