李文星，楊解人，張俊秀，唐麗娟，楊 慧，陳國祥

(皖南醫(yī)學院 藥理學教研室，安徽 蕪湖 241002)

高血壓導致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的發(fā)生率呈上升趨勢。近年來，美國ESRD的發(fā)病率以每年9%的速度增長，其中因高血壓而引起的ESRD患者占28%，這提示著臨床上抗高血壓藥物對腎功能的保護作用還遠遠不夠［1］。因此，研究和開發(fā)防治高血壓腎損害的藥物有著重要的意義。

自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)血壓在16 周齡時可達180 ～200 mmHg，發(fā)病機制以及并發(fā)癥等都與人類高血壓患者相似，是目前國際上公認人類原發(fā)性高血壓及其并發(fā)癥研究和藥物篩選最佳的動物模型［2］。

復方山菊是由野菊花、淫羊藿、羅布麻葉及鉤藤組成的新型復方中藥制劑。其中山菊有降壓、抑制血小板聚集、抗炎抗氧化的作用［3］。淫羊藿對內(nèi)皮細胞具有保護作用，有保護心血管、調節(jié)免疫的作用［4］。羅布麻葉有降壓、降脂、增強免疫功能等作用［5］。鉤藤能降壓、抗心律失常、抑制血小板聚集和抗血栓形成作用［6］。臨床應用證明，將上述4種中藥組成復方山菊制劑具有降壓作用，我們前期動物實驗也證實口服復方山菊能明顯降低SHR血壓和血脂以及血粘度［7］，具有改善SHR心肌肥厚，降低血尿酸等作用［8］，但長期應用對SHR腎臟損傷是否具有保護作用，目前未見報道，本試驗采用SHR，連續(xù)灌服復方山菊16周，觀察其對腎臟損傷的保護作用及可能機制，為臨床用藥進一步提供實驗和理論依據(jù)。

高血壓能增加腎小球毛細血管內(nèi)壓，使腎臟固有細胞產(chǎn)生多種炎性因子、生長因子和血管活性物質。這些活性因子通過自分泌和旁分泌等途徑進一步作用于系膜細胞等腎固有細胞，導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)積聚，從而造成腎小球硬化，最終導致腎衰竭。TGF-β1是最重要的促纖維化因子，在腎小球硬化發(fā)生的最后通路作用尤為重要。TGF-β1可以刺激系膜細胞增殖，增加腎小球連接蛋白、膠原纖維、蛋白多糖等合成，使ECM合成增加，最終誘發(fā)腎小球硬化和腎小管腎間質纖維化［9，10］。而誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)，導致機體產(chǎn)生大量的和 NO，直接引起腎小球細胞損傷［11～13］。故本文從這兩條途徑來探討復方山菊對腎臟損傷保護作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 動物 雄性16周齡SHR 35只，Wistar-Kyoto(WKY)大鼠7只，體重(300±50)g。許可證號SCXK(滬)2007-0005，上海斯萊克實驗動物有限責任公司。顆粒飼料，南京青龍山動物試驗中心。自然光照，自由進食飲水，室溫(23±2)℃，相對濕度60% ～65%。

1.2 藥物和試劑 復方山菊(蕪湖市中醫(yī)院提供，090314)，臨床劑型為膠囊，每粒含原藥0.1 g，實驗用藥物為原藥粉劑，其中1.0 g原藥相當于15 g生藥。卡托普利(常州制藥廠有限公司，09102411)，10 mg/片。HE染色劑:蘇木精，伊紅。Masson染液試劑盒(南京建成生物工程研究所)。免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。RT-PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。PCR引物:TGF-β1 上 游 引 物 5'-GCGACTCCTGCTGCTTT-3'，TGF-β1 下游引物 5'-CTGGCGAGCCTTAGTTTG-3'，擴增產(chǎn)物大小為350 bp(南京金斯瑞生物科技有限公司)，β-actin上游引物5'-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3'，下游引物5'-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3'，擴增產(chǎn)物大小為469 bp。

1.3 分組及給藥 復方山菊成人每日用量為0.4g(4粒)，按60 kg計算，折算成大鼠等效量為0.047 g/kg，以0.05 g/kg為等效量(低劑量組)，按3倍遞增為0.15 g/kg(中劑量組)，0.45 g/kg(高劑量組)。SHR 35只，給藥前測量大鼠清醒狀態(tài)血壓，根據(jù)血壓隨機分為5組:SHR(蒸餾水5 ml/kg)對照組，復方山菊低劑量組(0.05 g/kg)、中劑量組(0.15 g/kg)、高劑量組(0.45 g/kg)，卡托普利(0.03 g/kg)陽性對照組，每組7只。另設WKY正常對照組(蒸餾水5 ml/kg)7只。按上述劑量，每日下午5時灌胃給藥(容積為5 ml/kg)，每日1次，連續(xù)16周。

1.4 HE染色和Masson染色 末次給藥后，3%戊巴比妥鈉(10mg/kg)麻醉，取腎臟組織，濾紙拭干。10%甲醛固定，包埋，切片，HE染色，光鏡觀察腎組織病理學改變。Masson染色(具體步驟參照試劑盒說明書)腎組織切片，光鏡下觀察腎膠原纖維的表達。

1.5 免疫組化法表達腎組織中iNOS蛋白 腎組織石蠟橫斷面切片，厚度約4 μm/片，常規(guī)脫蠟至水，染色程序嚴格按照試劑盒步驟進行，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片觀察。實驗步驟參照試劑盒說明書。

結果判斷:iNOS定位于腎小球細胞的胞漿及胞膜。陽性細胞呈黃至棕黃色。所有染色切片在同一條件下采用Image-pro plus圖像分析軟件進行半定量分析，測定其平均積分光密度值(AIOD)，陽性表達水平用AIOD(±s)表示，AIOD越大其iNOS表達水平愈高，反之則表達水平愈低。

1.6 RT-PCR法表達腎臟TGF-β1 mRNA Trizol一步法提取腎皮質總RNA，測量各組260 nm和280 nm紫外吸收值(A)，重復測定3次。結果各組A260/A280在1.8～2.0之間，說明所提RNA純度高。根據(jù)A260值計算RNA濃度。取總RNA 2 μg做逆轉錄，實驗步驟參照逆轉錄試劑盒說明書進行。取1 μg cDNA逆轉錄產(chǎn)物為模版，再利用特異性引物擴增目的片段，反應體系為25 μl。目的基因擴增條件如下:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)，再次72℃延伸5 min。取5 μl擴增產(chǎn)物在含溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，采用Image-pro plus圖像分析軟件進行半定量分析，條帶強度用IOD值表示。目的基因的信號強度以目的基因/β-actin的IOD比值來確定目的基因的表達。

2 結果

2.1 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠腎小球HE染色的影響 光鏡下，WKY大鼠腎小球大小形態(tài)正常，毛細血管袢開放，系膜細胞和基質無增生，基質膜未增厚，腎小管上皮細胞無變性，管腔內(nèi)未見管型，腎間質未見纖維化及炎細胞浸潤，腎小動脈管壁無增厚。與WKY比較，SHR腎小球球性硬化伴萎縮，腎小管顆粒變性伴萎縮，腎間質多灶性纖維化伴淋巴-單核細胞浸潤，腎小動脈管壁增厚，管腔狹窄，說明SHR伴有嚴重的腎小球損傷。與SHR比較，隨著復方山菊劑量的增加腎小球系膜細胞和基質增生逐漸減輕，腎小管顆粒變性逐漸改善，腎間質內(nèi)炎細胞浸潤逐漸減少，纖維化逐漸減輕，腎小球病變有明顯的改善，說明復方山菊對SHR腎小球損傷有一定的改善作用(圖1)。

圖1 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠腎小球HE染色的影響(400×)Fig 1 Effects of compound Shanju on renal glomerulus of SHR by HE staining(400×)

2.2 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠腎小球MASSON染色的影響 MASSON染色顯示膠原纖維為藍色，與WKY比較，SHR腎小球系膜區(qū)出現(xiàn)明顯藍色深染，說明SHR腎小球伴有嚴重的膠原沉積。與SHR比較，隨著復方山菊劑量的增加，腎小球系膜區(qū)藍色深染逐漸減少，膠原沉積現(xiàn)象逐漸減輕，說明復方山菊對SHR腎小球膠原沉積有一定的改善作用(圖2)。

圖2 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠腎小球MASSON染色的影響(400×)Fig 2 Effects of compound Shanju on renal glomerulus of SHR by Masson's trichrome staining(400×)

2.3 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠腎小球iNOS表達的影響 免疫組化顯示，陽性表達為棕黃色顆粒，SHR棕黃色顆粒較多(圖3)，通過對其AIOD進行半定量分析得出，腎小球iNOS表達顯著增加(P＜0.01)(圖4)，與SHR比較，隨著復方山菊劑量的增加棕黃色顆粒逐漸減少(圖3)，腎小球iNOS表達逐漸減少(P＜0.01)(圖4)。說明復方山菊能下調SHR腎小球iNOS的表達。

圖3 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠腎小球iNOS表達的影響(400×)Fig 3 Effects of compound Shanju on the expression of iNOS in renal glomerulus of SHR(400×)

圖4 復方山菊對SHR腎小球iNOS平均積分光密度值(AIOD)的影響(±s，n=7)Fig 4 Effects of compound Shanju on AIOD of iNOS in renal glomerulus of SHR(±s，n=7)

2.4 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟TGF-β1 mRNA表達的影響 與WKY比較，SHR腎臟TGF-β1 mRNA表達顯著增加。與SHR比較，復方山菊高、中劑量和Cap組腎臟TGF-β1 mRNA表達減少(P＜0.01)。說明復方山菊和Cap能下調SHR腎臟 TGF-β1 mRNA(圖 5)。

3 討論

本實驗研究結果顯示，SHR腎小球球性硬化伴萎縮，腎小管顆粒變性伴萎縮，腎間質多灶性纖維化伴淋巴-單核細胞浸潤，腎小動脈管壁增厚，管腔狹窄，系膜區(qū)膠原纖維沉積，說明SHR伴有嚴重的腎小球損傷。經(jīng)復方山菊16周治療后，SHR腎小球系膜細胞和基質增生逐漸減輕，腎小管顆粒變性逐漸改善，腎間質內(nèi)炎細胞浸潤逐漸減少，纖維化逐漸減輕，系膜區(qū)膠原纖維沉積逐漸減少，腎小球病變有明顯的改善，表明復方山菊對SHR腎小球損傷具有改善作用。

圖5 復方山菊對SHR腎臟TGF-β1 mRNA表達的影響(±s，n=7)Fig 5 Effects of compound Shanju on the expression of TGF-β1 mRNA in renal glomerulus of SHRA:Expression of TGF-β1 mRNA in renal glomerulus of SHR(1.WKY，2.SHR，3.compound Shanju 0.45 g/kg，4.compound Shanju 0.15 g/kg，5.compound Shanju 0.05 g/kg，6.Cap 0.03 g/kgB:Histogram represents integrated optical density(IOD)normalized to the corresponding β-actin(±s，n=7，a P＜0.05，aa P＜0.01 vs WKY;b P ＜0.05，bb P ＜0.01 vs SHR;c P ＜0.05，cc P ＜0.01 vs Cap

復方山菊通過何種機制保護SHR腎小球?文獻報道，高血壓時腎小球內(nèi)高壓，使腎小球內(nèi)血管內(nèi)皮細胞功能損傷，導致舒血管物質一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)合成減少，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)生成增加;而AngⅡ可誘導腎臟系膜細胞產(chǎn)生轉化生長因子β1(TGF-β1)。TGF-β1以自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌的方式，激活Smad2、Smad3和 Smad4，形成多聚體進入胞核內(nèi)，誘導和刺激胚胎基因表達，激活MAPK途徑，促進腎小球系膜細胞增生、細胞外基質(ECM)形成和沉積，抑制ECM降解，促使ECM在系膜區(qū)聚積，最終誘發(fā)腎小球硬化和腎小管腎間質纖維化［9，10］。進一步實驗顯示，復方山菊高、中劑量組的腎小球TGF-β1 mRNA表達比SHR組顯著下降，說明復方山菊可通過下調腎小球TGF-β1 mRNA的表達，從而減少腎小球膠原沉積，減輕腎小球硬化。

此外，高血壓時，活性氧(ROS)生成增多，NF-κB被激活，激活的NF-κB可增加 TGF-β1的生成，促使ECM聚積，而這又反過來進一步激活NF-κB，大量被激活的NF-κB可活化生成誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)，導致機體產(chǎn)生大量的和NO，引起腎小球細胞損傷［11～13］。本次研究結果顯示復方山菊高中劑量組腎組織iNOS的表達與SHR組相比有顯著下降，說明復方山菊可通過下調SHR腎臟iNOS蛋白的表達，減輕腎小球細胞的變性、萎縮、玻璃樣變等病理性損傷。說明復方山菊是通過下調腎小球TGF-β1 mRNA和iNOS蛋白的表達，以減少腎小球膠原沉積，減輕腎小球硬化和腎小球細胞的病理損傷，從而改善腎功能，產(chǎn)生保護腎臟的作用。

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