鄢海燕，鄒純才

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.藥劑學(xué)與生藥學(xué)教研室;2.藥物分析與藥物化學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

熊膽為熊科動(dòng)物黑熊Selenaretos thibetanus cuvie或棕熊Ursus arctos的干燥膽，為貴重中藥?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)熊膽具有保肝利膽、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抑菌、解熱作用，臨床上廣泛用于眼科、五官科、消化科、神經(jīng)科［1～5］。20世紀(jì)80年代我國(guó)逐步進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究，首先進(jìn)行了化學(xué)成分、質(zhì)量控制等項(xiàng)研究，其次進(jìn)行了藥理、藥效及臨床研究，并對(duì)熊膽粉制劑進(jìn)行了開(kāi)發(fā)研究。現(xiàn)廣泛采用導(dǎo)管活體引流熊膽汁干燥而成，即引流熊膽。然而這種做法不利于熊的保護(hù)，因此尋找天然熊膽的替代品成為必然。此外市場(chǎng)上常以牛、豬、雞膽汁干燥加工成粉或混合充當(dāng)熊膽粉出售，因此有必要建立快速鑒別方法。本研究探討了熊膽粉與牛、豬、雞膽汁粉的傅立葉變換-紅外吸收光譜(FT-IR)特征以利于它們的鑒別并對(duì)其藥理作用進(jìn)行比較，為尋找天然熊膽粉代用品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 材料 天然熊膽粉(四川省簡(jiǎn)陽(yáng)市威杰養(yǎng)殖場(chǎng);批號(hào):20050216;批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000053);牛膽粉、豬膽粉、雞膽粉為自制品，由新鮮牛膽、豬膽、雞膽(購(gòu)自蕪湖市月河星城菜市場(chǎng)及氵魯港菜市場(chǎng))，分別剪開(kāi)膽囊膜取出膽汁，經(jīng)真空恒溫箱干燥制得。昆明種小鼠，雌雄各半，19～22 g，由皖南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供。戊四氮(SIGMA公司，純度≥99%，皖南醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心提供)，甘草片(批號(hào):20101001，四川蜀中制藥有限公司)，注射用苯巴比妥鈉(批號(hào):100907，福建省閩東力捷迅藥業(yè)有限公司)。

1.1.2 儀器 Nicolet380型智能傅里葉紅外光譜儀;YP-2壓片機(jī)(上海齊益電子儀器有限公司);WS70-1型遠(yuǎn)紅外快速干燥器(上海錦凱科學(xué)儀器有限公司);DZF-6030A型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 紅外光譜測(cè)定方法

1.2.1 樣品處理 分別將熊膽粉、豬膽粉、雞膽粉、牛膽粉置瑪瑙研缽中充分研細(xì)，置紅外燈下烘干，分別取上述烘干粉末約1 mg，加溴化鉀約100 mg，研磨混勻。

1.2.2 壓片 將磨好的物料加入到壓片模具中，鋪勻，合上模具，將模具放入壓片機(jī)上，壓到壓力表指針指向30 Mpa，稍停幾分鐘，使其壓成片狀。取出壓成透明片狀的物料，裝入樣品架待測(cè)。

1.2.3 紅外光譜測(cè)定 先進(jìn)行背景空白測(cè)定后，再把上述制備的樣品片置于光路中，在4 000～400 cm-1間繪制各樣品的紅外光譜。

2 結(jié)果

2.1 IR分析

2.1.1 相關(guān)IR光譜圖 不同動(dòng)物膽粉樣品及它們的混合品IR光譜，如圖1(a～i)所示。

圖1 各種膽粉的紅外光譜圖

2.1.2 各動(dòng)物膽的圖譜分析 熊膽粉主要成分為熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸與?；撬岬慕Y(jié)合體［6］。IR圖譜顯示與牛磺熊去氧膽酸對(duì)照品IR圖譜［7］類似的特征:1 656 cm-1和1 557 cm-1雙峰為酰胺基吸收峰，其中1 656 cm-1為酰胺基中C=O的伸縮振動(dòng)峰，1 557 cm-1為酰胺基中NH彎曲振動(dòng)及C-N伸縮振動(dòng)峰的重峰;1 188 cm-1和1 051 cm-1為磺酸基(-SO3H)吸收峰。1 188 cm-1磺酸基吸收峰透光度與熊膽粉中熊去氧膽酸或鵝去氧膽酸與牛磺酸的結(jié)合比例有關(guān)，而它與2 954 cm-1的C-H伸縮振動(dòng)透光度比值(T 1 188 cm-1/2 954 cm-1)接近1.0。744 cm-1為-(CH2)n(n≥4)鏈烷烴的CH面內(nèi)搖擺振動(dòng)產(chǎn)生。

牛膽粉主要成分為膽酸、去氧膽酸和鵝去氧膽酸及它們與?；撬岷透拾彼岬慕Y(jié)合體［8］。其IR圖譜顯示了與熊膽粉類似特征:1 640 cm-1和1 536 cm-1雙峰為酰胺基吸收峰且兩峰峰強(qiáng)相同，其中1 640 cm-1為酰胺基中C=O的伸縮振動(dòng)峰，1 536 cm-1為酰胺基中NH彎曲振動(dòng)及C-N伸縮振動(dòng)峰的重峰;1 241 cm-1和1 076 cm-1為磺酸基(-SO3H)吸收峰;1 403 cm-1為氨基酸中COO-對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。

豬膽粉主要化學(xué)成分為豬去氧膽酸與甘氨酸的結(jié)合體［9］，豬膽粉IR圖譜沒(méi)有熊膽粉上述3個(gè)主要IR特征。

雞膽粉的主要化學(xué)成分為鵝去氧膽酸和膽酸與?；撬岬慕Y(jié)合體［10］。其IR圖譜與熊膽粉的IR圖譜基本一致，熊膽粉的3個(gè)主要IR特征雞膽粉圖譜中均有。

2.1.3 各膽粉混合樣品IR圖譜分析 熊膽粉與豬膽粉(1∶1)混合品的IR圖譜如圖。其圖譜特征:1 656 cm-1和1 557 cm-1酰胺基吸收峰變?yōu)橐粋€(gè)寬峰，T 1 188 cm-1/2 954 cm-1明顯降低。

熊膽粉與牛膽粉(1∶1)混合品的IR圖譜如圖1a。其圖譜特征:1 643 cm-1和1 548 cm-1酰胺基吸收峰峰強(qiáng)明顯不同，744 cm-1的吸收峰被掩蓋。

雞膽粉與豬膽粉(1∶1)混合品的IR圖譜如圖1i。其圖譜特征:1 656 cm-1和1 557 cm-1酰胺基吸收峰變?yōu)橐粋€(gè)寬峰，T 1 188 cm-1/2 954 cm-1明顯降低。

牛膽粉與豬膽粉(1∶1)混合品的IR圖譜如圖1h。其圖譜特征:1 643 cm-1和1 589 cm-1酰胺基吸收峰變?yōu)橐粋€(gè)寬峰，T 1 188 cm-1/2 954 cm-1明顯降低。

2.2 藥理作用

2.2.1 鎮(zhèn)咳作用 取昆明種小白鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為對(duì)照組(生理鹽水)、熊膽粉組(200 mg/kg)、豬膽粉組(200 mg/kg)、牛膽粉組(200 mg/kg)、雞膽粉組(200 mg/kg)和陽(yáng)性組(甘草片，200 mg/kg)，各組為灌胃給藥，于給藥后30 min，將小白鼠放入容器內(nèi)用氨氣熏1 min，立即取出小白鼠用燒杯扣住，記錄取離氨氣后3 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2 抗驚厥作用 除陽(yáng)性對(duì)照組為苯巴比妥鈉(0.03 g/kg)外，小鼠的選擇、分組及對(duì)照與樣品組同“2.2.1”，各組為灌胃給藥，給藥后1 h，每組均皮下注射戊四氮65 mg/kg，記錄20 min內(nèi)小鼠驚厥的反應(yīng)率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.3 解熱作用 除陽(yáng)性對(duì)照組為阿司匹林(200 mg/kg)外，小鼠的選擇、分組及對(duì)照與樣品組同“2.2.1”，于實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室(環(huán)境溫度28℃，相對(duì)濕度60%)適應(yīng)環(huán)境，并測(cè)其肛溫2次/d，以了解小鼠體溫恒定與否，并使其適應(yīng)測(cè)定肛溫操作刺激。各組小鼠分別從背部皮下注射20%安琪高活性干酵母混懸液2.5 ml/kg，2 h后各組分別灌胃給藥，空白對(duì)照組給予同體積蒸餾水，并于給藥后1.5 h測(cè)量肛溫。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 熊膽等四種膽鎮(zhèn)咳、抗驚厥及解熱作用結(jié)果

3 討論

本研究采用了IR法可快速準(zhǔn)確地定性鑒別出熊膽粉與牛膽粉、豬膽粉或四種膽粉的相互混合品。有文獻(xiàn)報(bào)道采用TLC法［11］和HPLC法等鑒別熊膽粉與牛膽粉、豬膽粉和雞膽粉等其他動(dòng)物膽類藥材，TLC法簡(jiǎn)單易行，但一是需要對(duì)照品且分析樣品需前處理，二是展開(kāi)劑往往具有一定的毒性。HPLC法雖也較常用，但一方面膽酸類成分僅有末端吸收，因此應(yīng)用紫外檢測(cè)器很易產(chǎn)生基線漂移，另一方面分析時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，往往需要對(duì)照品，分析成本相對(duì)較高。而采用IR法，一是樣品不需前處理，可直接壓片測(cè)定，分析時(shí)間較短，二是牛磺熊去氧膽酸和?；蛆Z去氧膽酸等標(biāo)準(zhǔn)品的IR光譜可查閱有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行比較，故不需要對(duì)照品，分析成本低。

紅外吸收光譜一般要求樣品的純度大于98%，可用于分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)研究以及化學(xué)組分的分析。紅外光譜特點(diǎn)決定它只能反映出樣品中主要化學(xué)成分的紅外光譜特征。熊膽粉主要含有熊去氧膽酸及鵝去氧膽酸等?；撬峤Y(jié)合型去氧膽酸，而膽酸含量低，故其紅外光譜圖中沒(méi)有明顯的-C-O-H面外彎曲振動(dòng)特征吸收峰。豬膽粉中的主要成分為豬去氧膽酸與甘氨酸的結(jié)合體，不含有?；撬峤Y(jié)合體，因而不具有酰胺基吸收峰(1 656 cm-1和1 557 cm-1)，也不具有磺酸基吸收峰(1 188 cm-1和1 051 cm-1)。雞膽粉中的主要成分鵝去氧膽酸與熊膽粉中的主要成分熊去氧膽酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，只在-OH的空間構(gòu)型上存在差別，即它們?yōu)椴钕虍悩?gòu)體，因此IR法不能用于熊膽粉與雞膽粉的鑒別。

四種膽粉均具有鎮(zhèn)咳、抗驚厥和解熱作用，其中牛膽粉和雞膽粉鎮(zhèn)咳作用較強(qiáng)，豬膽粉抗驚厥作用最強(qiáng)，而牛膽粉和豬膽粉的解熱效果較好。

(致謝:皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥劑學(xué)與生藥學(xué)教研室包淑云博士對(duì)紅外吸收光譜的錄制給予了大力幫助，藥學(xué)系2007級(jí)學(xué)生朱淑珍參與了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理，在此表示感謝。)

［1］李剛峰.熊膽藥理作用的研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2002，14(1):3-5.

［2］丁濤，溫富春，周繼胡，等.精制熊膽粉活血化瘀作用研究［J］.中國(guó)天然藥物，2005，3(3):184-186.

［3］白云，蘇云明，白海玉，等.熊膽膠囊解熱鎮(zhèn)痛作用研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2005，33(6):26-27.

［4］劉嘉，萬(wàn)春艷.熊膽粉溶膽結(jié)石的作用研究［J］.中國(guó)林副特產(chǎn)，2007，(4):37-38.

［5］侯集瑞，王秀全，盛吉明等.熊膽茶對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物保護(hù)作用的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26(2):162-164，178.

［6］張啟明，梁及年，嚴(yán)克東，等.薄層色譜法測(cè)定引流熊膽中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量［J］.藥物分析雜志，1990，10(2):102.

［7］袁丹，金鳳，于山川，等.FT-IR法定性鑒別熊膽粉等常見(jiàn)動(dòng)物膽類藥［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2010，12(1):30-32.

［8］張贇華，劉建忠，彭霞，等.HPLC法比較熊膽粉及豬膽粉、牛膽粉、羊膽粉和雞膽粉中膽汁酸類成分［J］.藥物分析雜志，2009，29(3):487-490.

［9］張啟明.牛膽粉的化學(xué)研究［J］.藥物生物技術(shù)，1997，4(1):58-60.

［10］游元元，萬(wàn)德光.動(dòng)物膽汁藥用研究進(jìn)展［J］.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29(4):58-61.

［11］陳新.幾種常見(jiàn)熊膽偽品的鑒別［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，15(4):295-296.