白曉燕，李 巖

(遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州遵義 563099)

尿道下裂是臨床常見(jiàn)的先天性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常疾病之一，其主要原因是由于包皮前表面及陰莖的尿道發(fā)育停止，從而使尿道發(fā)生畸形而不能于正常位置開(kāi)口，常并發(fā)陰莖彎曲［1，2］。尿道下裂發(fā)病原因目前尚未完全明確，多認(rèn)為是環(huán)境與基因改變共同導(dǎo)致［3，4］。雖然手術(shù)治療作為尿道下裂重要的治療方法取得不斷發(fā)展，但手術(shù)并發(fā)癥較多，并且由于工業(yè)發(fā)展帶來(lái)的環(huán)境污染的加重使其發(fā)生率也成明顯上升趨勢(shì)［5］，因此對(duì)尿道下裂發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步研究以對(duì)其預(yù)防及治療提供指導(dǎo)均有重要意義。

氟他胺(flutamide，F(xiàn)lu)是一種用于制造尿道下裂動(dòng)物模型的常用非類(lèi)固醇類(lèi)抗雄激素藥物，在其作用下，尿道生殖結(jié)節(jié)顯示有敞開(kāi)的、連續(xù)的尿道生殖溝，尿生殖褶融合受到影響，尿道生殖褶亦受到影響而不能向陰莖腹側(cè)中線融合，以上原因共同導(dǎo)致尿道開(kāi)口的位置異常，成為引起尿道下裂的重要原因。已有研究顯示給予一定劑量的Flu，子代雄鼠尿道生殖結(jié)節(jié)和睪丸組織中相關(guān)凋亡基因的表達(dá)將受到影響，引起尿道下裂［6，7］，但究竟是通過(guò)直接與受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合還是直接降低雄激素受體(androgen receptor，AR)表達(dá)目前尚未明確。我們?cè)谙嚓P(guān)研究基礎(chǔ)上，通過(guò)Flu染毒建立尿道下裂動(dòng)物模型，觀察染毒后子代雄性大鼠增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)以及AR表達(dá)變化，進(jìn)一步探討Flu引起尿道下裂的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 對(duì)象

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Sprague Dawley大鼠(SPF級(jí)，約8周齡)30只 (受孕雌鼠20只，雄性10只，四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重230～250 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后雌、雄均隨機(jī)分為2組 (對(duì)照組和Flu染毒組各15只)。

1．1．2 試劑 氟他胺(江蘇第一藥業(yè)，批號(hào):03012);I抗:PCNA鼠抗大鼠 BM0104及AR兔抗大鼠BA0004(武漢博士德);II抗SP9000羊抗兔IgG(上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑公司 );DBA顯色劑ZLI9032(北京中杉金橋生物工程有限公司)。封閉用正常山羊血清工作液(上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑公司)，生物素化二抗工作液(北京中杉金橋生物工程有限公司)，辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液(北京中杉金橋生物工程公司)。樣本組織mRNA提取和純化試劑盒(美國(guó)，Clontech);TrizolTMRNA Isolation Reagent(美國(guó)，Gibco);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(立陶宛，MBI)。

1．1．3 儀器 顯微鏡(OLYMPUS，日本)、Mias－200圖像分析儀、Leitz－1515輪轉(zhuǎn)式手搖切片機(jī)(Heraeus，西德);GeneAmp PCR System 9600 PE(美國(guó)，Perkin Elmer)。FTC2000型熒光定量PCR儀。低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)，Heraeus)。電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)，Bio－rad)。

1．2 方法

1．2．1 染毒方法 將30只大鼠按雄性與雌性比例為1∶2，于18∶00合籠后，第二日8∶00觀察雌鼠陰栓，如發(fā)現(xiàn)有陰栓為孕第0天。染毒組孕鼠在第12～17天連續(xù)6 d，每天8∶00腹部皮下注射用生理鹽水配制的Flu(6．0 546 mg/kg)，對(duì)照組給予等量NS。

1．2．2 標(biāo)本采集 于孕 20 d(gestation days，GD20)解剖孕鼠，取出染毒組和對(duì)照組雄性仔鼠雙側(cè)睪丸，置于裝有RNA保存液的凍存管中液氮低溫保存。經(jīng)鑒定各組樣本mRNA提取質(zhì)量鑒定各項(xiàng)指標(biāo)符合實(shí)驗(yàn)要求，同時(shí)取出雄性仔鼠生殖結(jié)節(jié)。

1．2．3 免疫組化染色 標(biāo)本石蠟包埋、連續(xù)切片、脫蠟至水。3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗;將切片浸入PCNA、AR、使用0．01 M枸櫞酸緩沖液，pH 6．0，高壓加熱4 min，后自然冷卻20，min至室溫。PBS漂洗后滴加山羊血清工作液，室溫孵育10～15 min。滴加適量一抗(PCNA稀釋度1∶50;AR稀釋度1∶100)，4℃孵育過(guò)夜。滴加二抗，室溫下1 h，以上兩步均需用0．01mol/L PBS漂洗，DBA顯色，顯微鏡觀察后自來(lái)水終止顯色，蘇木素輕度復(fù)染。脫水、透明后中性樹(shù)膠封片，棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。滴加新鮮配置的DBA顯色劑，控制染色后自來(lái)水沖洗，終止顯色反應(yīng);蘇木素輕度復(fù)染后水洗。

1．2．4 RT －PCR RT －PCR 反應(yīng)引物、PCNA 及AR列(見(jiàn)表1)，反應(yīng)體系總體積50μl(Buffer 5 μl、MgCl2 5 μl、上下引物各 2 μl、Taq DNA Polymerse 0．3 μl、cDNA 模板 5 μl、DEPC － H2O 29 μl。反映條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min共35循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)模板樣品每毫升的初始拷貝數(shù)為 107、106、105、104、103。

表1 RT－PCR反映引物序列、PCNA及AR序列

1．3 統(tǒng)計(jì)分析 免疫組化圖像分析采用Simple PCI圖像分析儀，灰度值比較采用PEMS軟件。RT－PCR采用2－ΔΔCT法對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析。熒光定量PCR結(jié)果以ΔCT值表示，計(jì)算:ΔCT=CT(target gene)－ CT(引物);ΔΔCT= ΔCT(實(shí)驗(yàn)組)– ΔCT(對(duì)照組)，2－ΔΔCT表示各實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)表達(dá)量。所有數(shù)據(jù)以珋x±s表示，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，除灰度值外用SSPS 18．0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 一般情況 對(duì)照組雄性子代發(fā)育未見(jiàn)異常，尿道下裂的發(fā)生率均為0，F(xiàn)lu雄性子代表現(xiàn)出性分化和性發(fā)育異常，染毒組尿道下裂的發(fā)生率100%，提示 Flu 組染毒成功［7］。

2．2 指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2．2．1 PCNA GD20 PCNA 在 Flu組與對(duì)照組在生殖結(jié)節(jié)、間充質(zhì)細(xì)胞和尿道細(xì)胞及睪丸間充質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)見(jiàn)圖1～4;免疫組化圖像灰度分析結(jié)果見(jiàn)表2。RT－PCT結(jié)果顯示:Flu組與對(duì)照組ΔCT比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．05)，PCNA在Flu染毒組睪丸間質(zhì)細(xì)胞的活性較對(duì)照組表達(dá)降低了 37．2%(2－△△CT=0．628 ±0．105)。

2．2．2 AR GD20 AR在 Flu組與對(duì)照組尿道細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)見(jiàn)圖5～6;AR免疫組化圖像灰度分析結(jié)果見(jiàn)表2。RT－PCR結(jié)果顯示:Flu組與對(duì)照組ΔCT比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，AR在Flu染毒組睪丸間質(zhì)細(xì)胞的活性較對(duì)照組無(wú)明顯變化(2－△△CT=0．976 ±0．086)。

表2 PNCA及AR表達(dá)圖像灰度分析結(jié)果(珋x±s)

表3 PNCA及AR rt－PCR△CT值及2－△△C T法分析結(jié)果(珋x±s)

3 討論

PCNA是一種穩(wěn)定的細(xì)胞周期核蛋白，作為DNA聚合酶δ的輔助因子，PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用，因此PCNA的表達(dá)可反映局部細(xì)胞的增生狀態(tài)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)在胚胎20 d可觀察到Flu染毒組PCNA在生殖結(jié)節(jié)、間充質(zhì)細(xì)胞、尿道細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)減少(見(jiàn)圖1～4);圖像灰度值在生殖結(jié)節(jié)、間充質(zhì)細(xì)胞、尿道細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞中低于對(duì)照組，兩樣本均數(shù)的比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05，表1)，RT－PCR分析顯示PCNA mRNA在 Flu染毒組明顯減少，這提示Flu能夠降低睪丸間質(zhì)細(xì)胞中合成睪酮代謝相關(guān)基因PCNA表達(dá)，F(xiàn)lu染毒后，睪丸間質(zhì)細(xì)胞中合成睪酮代謝酶的活性受到抑制，睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖受到影響，導(dǎo)致其增生減少，將引起睪酮合成分泌量下降;并且在形成尿道的過(guò)程中，F(xiàn)lu也將導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞、尿道細(xì)胞、生殖結(jié)節(jié)等完整尿道形成所必須的細(xì)胞增殖同樣受到影響，在很大程度上也促進(jìn)了尿道下裂的發(fā)生發(fā)展。

AR在尿道發(fā)育過(guò)程中有重要作用［9］，與雄激素受體結(jié)合后，AR可促進(jìn)胎鼠整個(gè)尿道板由背側(cè)向腹側(cè)開(kāi)始融合，此過(guò)程也存在尿生殖褶的融合，它們共同形成有管的尿道［10］。圖5～6可見(jiàn)，F(xiàn)lu染毒后，在GD 20尿道細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞的AR表達(dá)與對(duì)照組相比并無(wú)明顯變化。圖像灰度值分析(表1)顯示AR在尿道細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞中比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05);RT－PCR分析也顯示AR mRNA在Flu染毒組與對(duì)照組無(wú)明顯變化，提示Flu染毒后并未引起雄激素受體量的改變，F(xiàn)lu在尿道下裂的作用機(jī)制，可能主要是通過(guò)影響雄激素合成代謝來(lái)改變雄激素水平，F(xiàn)lu導(dǎo)致拮抗雄激素的作用，主要表現(xiàn)為通過(guò)與雄激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合AR，對(duì)AR－DNA以及雄激素依賴(lài)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行阻斷，相應(yīng)的細(xì)胞功能受到影響，從而阻礙了性分化和性發(fā)育。

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