蔣程程，鄧金勇 ，宋慶高，何 葦 ，陳 尚

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴州遵義 563099)

骨膜牽張成骨(periosteal distraction osteogenesis，PDO)是一種通過誘導(dǎo)骨膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞后進(jìn)而獲得新生骨的緩慢生物學(xué)過程，但這種成骨方法不同于牽張成骨技術(shù)，PDO不需截骨術(shù)或骨皮質(zhì)切開術(shù)，僅是對(duì)骨皮質(zhì)表面的骨外膜進(jìn)行牽張［1］。目前可通過多種方法來對(duì)實(shí)驗(yàn)成骨效果進(jìn)行評(píng)估，如超聲波檢查、X線檢查［2］、CT 掃描［3］、生物力學(xué)檢測［2］、組織學(xué)觀察［3］等。本課題組已成功將PDO技術(shù)應(yīng)用在犬腭裂模型上，并通過腭裂骨緣組織學(xué)觀察得到骨膜成骨良好的結(jié)論［4］。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)其成骨過程進(jìn)行熒光組織化學(xué)分析，以研究骨膜牽張成骨的連續(xù)過程及規(guī)律，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 12～14月齡的健康雜種犬10只，雄性，體重10～15 kg。隨機(jī)分組，空白對(duì)照組2只，飼養(yǎng)60 d后處死;實(shí)驗(yàn)組8只隨機(jī)分為四組，每組2 只，牽張 20、30、40、60 d 后處死，牽張器放置側(cè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)，未放置側(cè)為自身對(duì)照側(cè)。

1．2牽張裝置［4］本實(shí)驗(yàn)采用的鎳鈦記憶合金牽張器為自行設(shè)計(jì)并制作，主體分為兩部分:施力部分與固位部分。該材料具有良好的超彈性及形狀記憶效應(yīng)，即在一定范圍內(nèi)，隨著環(huán)境溫度的變化，牽張器發(fā)生形變后可以產(chǎn)生恒定的牽張力。本實(shí)驗(yàn)所選用的骨膜牽張器在有效作用范圍內(nèi)的牽張力值為250±20g。

1．3 手術(shù)方法 實(shí)驗(yàn)組在全麻下于腭中縫處切除長約2．0 cm、寬約0．6 cm的全層組織，形成人工硬腭裂。模型建立2月后，行第2次手術(shù)安置牽張器:首先將實(shí)驗(yàn)側(cè)粘骨膜與骨面剝離分開，把未發(fā)生形變的牽張器放置于骨面并作充分貼合，鈦合金固位釘固定后將切開處粘骨膜對(duì)位縫合，用熱鹽水紗布敷于牽張器處黏骨膜表面，使其溫度升高發(fā)生形變，此時(shí)骨膜與腭骨骨面之間出現(xiàn)間隙，即刻產(chǎn)生骨膜牽張力。

1．4 動(dòng)物處理 根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，分別在牽張器成功放置20、30、40、60 d 后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在處死動(dòng)物前倒數(shù)第14天和第3天對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行肌肉注射四環(huán)素，四環(huán)素用量按每公斤體重注射50 mg計(jì)算。切取腭裂家犬實(shí)驗(yàn)側(cè)與自身對(duì)照側(cè)裂隙緣骨組織以及空白對(duì)照組腭部骨組織，骨組織塊經(jīng)過石蠟包埋后，利用硬組織骨切片技術(shù)對(duì)骨組織進(jìn)行沿骨膜垂直方位切片，以備四環(huán)素?zé)晒馊旧^察新骨生成的動(dòng)態(tài)過程。

1．5 觀察方法及測量 在Leica熒光顯微鏡(波長為360～400 nm)下觀察腭部骨組織四環(huán)素?zé)晒馇衅⑴臄z照片。用LEICA圖象分析系統(tǒng)(CW4000 FISH)來進(jìn)行骨組織計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)參數(shù)測量分析，為減少測量誤差獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)每一實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本共選取5處視野，測量熒光雙標(biāo)記線間平均距離(SBDTL)和新生骨組織礦化沉積速率的平均值(MMAR)，嚴(yán)格按照完全隨機(jī)的原則收集整理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1．6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13．0進(jìn)行分析，經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)后行方差分析，組間比較方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Gunnett＇T3 法，以 P ＜0.05 認(rèn)為有差異。

2 結(jié)果

2．1 四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記觀察 骨膜牽張20 d后與對(duì)照組比較顯示:靠近裂隙邊緣處可觀察到少量早期形成的骨組織，其最外緣可見薄層的類骨質(zhì)，但熒光帶顯示較弱，連續(xù)性差，且排列紊亂，未見熒光雙標(biāo)記線。骨膜牽張30 d后比較顯示:裂隙邊緣處生成新骨量較牽張20 d組增多，類骨質(zhì)增厚，熒光帶明顯且排列較規(guī)整，連續(xù)均勻，并可見熒光雙標(biāo)記線，但間距較窄。骨膜牽張40 d后比較顯示:牽張區(qū)見大量成骨細(xì)胞，成骨活動(dòng)活躍，且骨小梁排列整齊，排列方向與表面骨膜相垂直，靠近骨膜表面處可見熒光雙標(biāo)記線顯示清晰，但成環(huán)不全。裂隙邊緣處新形成骨組織的髓腔較大，骨小梁內(nèi)側(cè)邊緣熒光雙標(biāo)記線間距較寬。骨膜牽張60 d后比較顯示:骨小梁排列整齊且粗壯，骨小梁表面雙線形熒光帶顯著，雙線間距明顯增寬，且成環(huán)。在新骨邊緣及骨陷窩處均可觀察到熒光帶，骨質(zhì)表現(xiàn)成熟(見圖1)。

2．2 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)參數(shù)測量分析結(jié)果自身對(duì)照側(cè)在靠近腭部裂隙緣處未見四環(huán)素?zé)晒怆p標(biāo)線形成，僅見少量散在熒光帶分布。在骨膜牽張成骨不同時(shí)期，實(shí)驗(yàn)組各組間熒光雙標(biāo)線間距及平均礦化沉積速率比較顯示，組間差異均有非常顯著意義(P＜0．01)(見表1)。

表1 四環(huán)素雙標(biāo)間距和平均礦化沉積率各自在腭骨骨膜牽張不同時(shí)期的比較

圖1 裂隙緣骨組織四環(huán)素標(biāo)記×100

3 討論

腭裂的骨性修復(fù)一直是個(gè)難題，由于是包括骨組織、口鼻腔粘膜的全層組織缺損，即使不考慮取骨處的二次損傷及骨吸收問題，軟組織不足問題就使植骨術(shù)在腭裂修復(fù)治療中無法順利進(jìn)行。近年來腭裂治療理論更多關(guān)注于術(shù)前矯正上，牙槽矯正器械就是通過緩慢加力的方式使牙槽嵴裂隙減小甚至關(guān)閉［5］，當(dāng)手術(shù)修復(fù)時(shí)往往不需要行髂骨松質(zhì)骨移植術(shù)，只需行牙齦下骨成形術(shù)即可。這是頜面部裂隙畸形治療方式的重大突破，但這種方法卻無法關(guān)閉腭部的軟硬組織裂隙。Abramo A C［6］曾試圖在術(shù)前及術(shù)中通過擴(kuò)展腭部的方式使軟組織量增加，以此達(dá)到腭部無張力縫合的目的，在一定程度上可以降低腭瘺、腭咽閉合不全的發(fā)生率，同時(shí)也可能對(duì)上頜骨發(fā)育影響減小。但這種方法同樣無法對(duì)腭部硬組織進(jìn)行修復(fù)，致使短期效果尚可，而長期效果還有待觀察。梁立民等［7］報(bào)道了骨縫牽引成骨封閉硬腭裂隙實(shí)驗(yàn)研究及初步臨床應(yīng)用，但此方法在適應(yīng)證上有一定限制，不能應(yīng)用于骨縫已發(fā)育完成的成年人，同時(shí)這種方法并發(fā)癥的發(fā)生如面寬度和腭骨段呼吸道寬度發(fā)育不足也見有報(bào)道［8］，因此骨外膜牽張成骨應(yīng)運(yùn)而生。

骨組織是一種能不斷再生與吸收的有機(jī)器官，這便可以依靠細(xì)胞活力與生物力學(xué)來重塑骨形態(tài)，Ilizarov［9］證實(shí)穩(wěn)定的牽張力作用于活體組織后可以刺激并維持某些組織結(jié)構(gòu)如骨組織的再生，隨后成功將長骨的牽引成骨技術(shù)應(yīng)用于臨床。近來國內(nèi)外進(jìn)一步將牽張成骨技術(shù)應(yīng)用于頜面部，同樣也可以誘導(dǎo)新骨形成，而且在新生骨中未見軟骨或纖維軟骨，成骨方式為骨膜下成骨。近十年來PDO更多的應(yīng)用于顱頜面缺損畸形，其成骨原理是當(dāng)骨膜被緩慢牽張后，可以刺激新骨的形成。Kostopoulos［10］將四氟乙烯材料的囊狀物固定于大鼠下頜支皮質(zhì)骨表面，觀察到了一定數(shù)量的新生骨組織形成。Schmidt［11］等以3 mm/d的牽張速度在牽張器置于家兔下頜支骨膜下第28、35、42、56天進(jìn)行牽張成骨，最后獲得約2．86 mm高度的新生骨，進(jìn)一步證實(shí)了PDO治療頜面部骨質(zhì)缺損的可行性，并強(qiáng)調(diào)PDO避免了牽張成骨術(shù)中的截骨術(shù)或皮質(zhì)骨切開術(shù)，盡可能的降低了損傷程度。腭裂骨缺損修復(fù)的同時(shí)，粘膜與肌肉也可以得到擴(kuò)張，其他較以往修復(fù)方法的優(yōu)勢如:①牽引方向可為中間與后方，關(guān)閉裂隙的同時(shí)也延長了硬腭長度;②鎳鈦記憶合金裝置可以提供持續(xù)的牽張力，而且便于臨床操作，減輕了工作量;③特制的牽張裝置適合安裝于薄弱的、不平坦的腭骨表面;④對(duì)于錯(cuò)過早期治療的大齡兒童，這種方式也較適合。因此，這項(xiàng)技術(shù)臨床應(yīng)用前景極為廣闊。

四環(huán)素類藥物與骨組織有很強(qiáng)的結(jié)合力，在骨內(nèi)膜、骨外膜等成骨活躍的部位較易沉積，沉積在骨內(nèi)的四環(huán)素在紫外線照射激發(fā)下產(chǎn)生熒光，從而標(biāo)示新生骨的分布區(qū)域與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可作為骨生成情況的動(dòng)態(tài)觀察指［12］。本實(shí)驗(yàn)通過四環(huán)素雙標(biāo)記的方法，把時(shí)間因素標(biāo)記在骨膜牽張成骨過程中，在牽張器放置20 d后可見牽張區(qū)內(nèi)出現(xiàn)排列紊亂、不連續(xù)的熒光帶，表明開始有成骨活動(dòng)。在牽張器放置30 d后牽張區(qū)成骨活動(dòng)活躍，出現(xiàn)排列規(guī)整、連續(xù)均勻的高亮度熒光帶。在牽張器放置40 d后牽張區(qū)成骨活動(dòng)更加活躍，熒光帶主要分布在長軸沿牽張力作用方向的大量新生平行骨小梁表面。由于新骨生成是由裂隙緣處向中央的纖維組織發(fā)展，因此，不同部位的新骨組織成熟度也不相同。在靠近原骨切口線界面早期形成的新骨組織內(nèi)，可見熒光失去連續(xù)性，說明為適應(yīng)正常生理可能的需要，骨小梁開始改建并逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榕c應(yīng)力負(fù)荷相適應(yīng)的交織結(jié)構(gòu)。在牽張器放置60 d后，牽張區(qū)較為成熟的骨組織繼續(xù)沉積鈣化，而晚近形成的骨小梁的沉積成熟與改建過程同時(shí)進(jìn)行。四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記法研究的結(jié)果與前期實(shí)驗(yàn)PDO新生骨質(zhì)組織學(xué)特征的觀察結(jié)果相符。

腭裂牽張成骨多采用自行設(shè)計(jì)的牽張器，牽張裝置樣式繁多，隨著骨膜牽張成骨的研究，逐漸出現(xiàn)牽張裝置不穩(wěn)定而引起的一系列并發(fā)癥如牽張器移位影響成骨效果、牽張裝置部分暴露造成繼發(fā)感染進(jìn)而導(dǎo)致失敗［13］，本實(shí)驗(yàn)采用的是內(nèi)置式的鎳鈦記憶合金牽張器，組織相容性好，同時(shí)制作簡單，操作方便，鈦合金固位釘固位于牽張器的固定端，保證了牽張過程的穩(wěn)固，這是牽張成骨成功的關(guān)鍵。相對(duì)于半置入式或外置式牽張器，內(nèi)置式牽張器全埋伏于骨膜下且保證骨膜無損傷可減少感染幾率，牽張裝置小型化也可以減少異物感，有利于功能活動(dòng)，盡量避免影響正常生活質(zhì)量。不同于以往牽張器，牽張速度及頻率需手動(dòng)調(diào)節(jié)，效果的好壞很大程度上取決于患者的依從性，鎳鈦記憶合金低溫下形變，隨著置入體內(nèi)環(huán)境后溫度上升，無需外力加載就可以對(duì)骨膜產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的牽張力，從生理上更符合骨組織生長要求。同時(shí)牽張過程無需延遲期、牽張期、固定期［14，15］等步驟，保證成骨質(zhì)量的同時(shí)也大大簡化了成骨過程。

原發(fā)性唇腭裂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型現(xiàn)已較成熟的應(yīng)用于小鼠［16，17］，是用具致畸作用的誘導(dǎo)劑如糖皮質(zhì)激素類及維生素A類等藥物誘導(dǎo)建立的，也主要用于病因?qū)W和發(fā)病機(jī)理研究。本實(shí)驗(yàn)采用健康家犬經(jīng)手術(shù)切除部分硬腭組織建立人工腭裂模型，由于犬口裂大，有利于手術(shù)及術(shù)后觀察，模型建立2月后未見裂隙關(guān)閉并開始進(jìn)行持續(xù)的骨膜牽張，四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記示成骨過程穩(wěn)定為進(jìn)一步應(yīng)用臨床提供基礎(chǔ)。但人工腭裂模型的解剖結(jié)構(gòu)與先天性腭裂有一定差別，這有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其成骨差異。

本研究設(shè)計(jì)的骨膜牽張成骨技術(shù)是一種以局部自身新生軟硬組織的增生為基礎(chǔ)，在修復(fù)腭裂缺損軟硬組織的前提下，關(guān)閉裂隙的功能性腭裂整復(fù)術(shù)，開拓了腭裂治療的新途徑，為臨床應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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