吳波，李薇，江慶萍，喻良文，張惠球（.廣州醫(yī)學院藥學系，廣州508；.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州 50006）

參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）屬鉅蚓科動物，藥材習稱“廣地龍”，在《中國藥典》收載的4個地龍來源中被認為品質(zhì)最優(yōu)，也是廣東省著名的道地藥材。目前，參環(huán)毛蚓仍主要依靠野生資源，加上不同環(huán)境條件以及采收加工技術(shù)的影響，造成藥材質(zhì)量極不穩(wěn)定，其中重金屬超標問題一直難以控制。目前，國內(nèi)、外學者大多從生態(tài)毒理學的角度研究不同種系的毛蚓對土壤重金屬的生物特性變化，并著眼于將毛蚓當作環(huán)境污染的指示生物或作為生態(tài)修復的工具，較少以改善藥用資源為目的，進行重金屬污染對藥用毛蚓的相關(guān)研究[1]。筆者擬應用免疫組化研究金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）在參環(huán)毛蚓不同組織中的表達，以評價重金屬鎘的污染對參環(huán)毛蚓的影響，探索參環(huán)毛蚓對重金屬鎘在體內(nèi)的生物富集機制，并為控制參環(huán)毛蚓體內(nèi)重金屬離子富集或加速其排泄提供依據(jù)。這對于從源頭上解決參環(huán)毛蚓的重金屬超標問題具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CX31型顯微鏡、FE5000型數(shù)碼相機（日本Olympus公司）；HM 355 S型全自動輪轉(zhuǎn)切片機（德國Microm公司）。

1.2 試藥

嗜鉻素A（英國Novocastra公司，批號：14301305）；Chem-MateTMEnVision+/HRP Detection Kit（基因科技（上海）有限公司，批號：25 J1776647490013）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB，包含B、C液，上海工碩生物技術(shù)有限公司）；福爾馬林、氯化鎘、過氧化氫、二甲苯、檸檬酸三鈉、檸檬酸、無水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸（EDTA）等試劑均為分析純。

1.3 動物

參環(huán)毛蚓采自廣東省從化市，由廣州中醫(yī)藥大學中藥學院喻良文教師提供，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學吳文如講師鑒定為真品。選擇體型健壯、活力較強，性成熟、體表具有明顯生殖環(huán)帶，平均濕重約1300～1500 mg的健康蚯蚓。在清潔的土壤中飼養(yǎng)24 h后，投入重金屬誘導養(yǎng)殖條件下土壤中，飼養(yǎng)于溫度25℃、空氣濕度為70%～80%的人工氣候箱中。

1.4 土壤

選擇從化田間參環(huán)毛蚓的原生長地較為肥沃的土壤，以生長有較為肥大的蚯蚓土壤作為選擇標準，經(jīng)測定，含水量為15.4%，pH值為4.40，鎘離子含量為0.28 mg·kg－1。

2 方法

2.1 DAB工作液的配制

試驗前，每1 mL DAB的B液中加20μL DAB的C液，按此比例配制所需用量，混勻，貯藏，備用；PBS緩沖液（pH 7.2～7.4）：NaCl 137mmol·L－1，KCl 2.7mmol·L－1，Na2HPO44.3 mmol·L－1，KH2PO41.4 mmol·L－1；0.01 mol·L－1檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH 6.0）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g，加水至1000 mL；0.5mol·L－1EDTA緩沖液（pH 8.0）：700mL水中溶解186.1 g EDTA·2 H2O，用10 mmol·L－1NaOH調(diào)pH值至8.0，加水至1000 mL。

2.2 試驗土壤的配制和重金屬誘導養(yǎng)殖試驗

2.2.1 鎘濃度的設定 根據(jù)《中華人民共和國國家標準土壤環(huán)境質(zhì)量標準》（GB15618-1995），以Ⅱ類土壤（適用于一般農(nóng)田、蔬菜地、茶園、果園、牧場等土壤，土壤質(zhì)量基本上對植物和環(huán)境不造成危害和污染）中所含鎘離子濃度0.6 mg·kg－1為基數(shù)，加入土壤中鎘離子濃度為基數(shù)濃度的5、10、20、30、40、50倍，共6個組。誘導培養(yǎng)基的鎘濃度見表1。

2.2.2 含重金屬離子土壤的處理 稱取適量的氯化鎘用研缽研磨均勻，再與適量的土壤混合，研缽研磨均勻后，以等量遞增法進行重金屬離子在土壤中含量的稀釋，加入氯化鎘（以重金屬鎘離子計算，即為污染組）濃度分別為3、6、12、18、24、30 mg·kg－1，每1個濃度設1個重復，同時設立空白對照組（未加入氯化鎘的土壤），然后土壤放至不同的培養(yǎng)箱中，并標記，詳見表1。

表1 誘導培養(yǎng)基的鎘濃度Tab 1 Cd concentration of induction culture medium

2.2.3 重金屬誘導養(yǎng)殖試驗 在每個培養(yǎng)箱中隨機加入10條健康的參環(huán)毛蚓，將培養(yǎng)箱置于室內(nèi)陰涼地方，拉上窗簾，以避免陽光直射，室溫保持在25～30℃，空氣濕度為70%～80%，土壤含水率為40%，pH 6.5，常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)14d。其間于每天上午10時和下午16時各觀察1次，記錄參環(huán)毛蚓的活動狀況。24、30 mg·kg－1組于培養(yǎng)9、7 d后死亡。

2.3 所用標本的前期處理

取各組參環(huán)毛蚓分別置于廣口瓶中，先用清水沖洗泥土，再用吸飽清水的濾紙覆蓋蚓體，將瓶口用紗布包好，保持室溫25℃，濾紙濕潤，饑餓48 h后，使消化道內(nèi)泥沙排泄干凈。再一次用清水沖洗泥土，然后用蒸餾水沖洗干凈，投入20%的乙醇溶液中麻醉15 min，用pH 7.4、0.1 mol·L－1PBS洗去參環(huán)毛蚓體表的黏液，然后解剖，獲取體壁和表皮、胃、腸、體腔標本。將以上標本置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片。切片用二甲苯脫蠟，乙醇梯度洗脫、蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸、乙醇分化30 s，蒸餾水浸泡15 min，置伊紅液中2 min，常規(guī)脫水，透明，封片，置于光學顯微鏡下觀察組織和細胞形態(tài)。

2.4 免疫組化反應

4 μm石蠟切片，用二甲苯脫蠟，乙醇梯度洗脫，加3%過氧化氫避光室溫孵育15 min，用0.01 mol·L－1（pH 6.0）檸檬酸緩沖液高壓修復抗原2 min，滴加50～100 μL一抗嗜鉻素A，室溫孵育30 min，再滴加50～100 μL ChemMateTMEnVision+/HRP，室溫孵育30 min，DBA顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化液分比，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細胞胞漿顯棕黃色顆粒為陽性。

3 結(jié)果

3.1 MT在腸道中的表達

從空白對照組參環(huán)毛蚓的腸道和整個體壁的組織切片染色中可看出，在腸腔和肌肉層均未檢測出MT表達。從污染組的腸道和整個體腔的組織切片染色中可看出，3 mg·kg－1濃度下，MT表達并不明顯，但隨著鎘濃度的增加，MT的表達越來越強（陽性細胞的數(shù)量不斷增加）。當染毒濃度達到18mg·kg－1時，其染色強度特別強，但染毒濃度在24 mg·kg－1（染毒時間為9 d）和30 mg·kg－1（染毒時間為7 d）時，其染色強度又明顯下降，這可能與其染毒時間相對較短有關(guān)。HE染色見圖1。

3.2 MT在表皮中的表達

在參環(huán)毛蚓各污染組的表皮層中，即角質(zhì)層和肌肉層之間，均可檢測到類似于MT表達的棕黃色顆粒，但是此棕褐色顆粒在空白對照組的表皮層也可檢測到，且與18 mg·kg－1組比較，沒有發(fā)現(xiàn)染色強度有明顯不同，這些棕黃色顆粒同樣可以在參環(huán)毛蚓表皮層切片的HE染色中發(fā)現(xiàn)。其它切片中（前列腺和素囊）未檢測到明顯的棕褐色顆粒。免疫組化圖片見圖2。

4 討論

MT是一類廣泛存在于生物中的低分子量、富含半胱氨酸、能被金屬誘導的金屬結(jié)合蛋白。1957年，Margoshes和Vallee首先于馬腎臟里分離出MT，后經(jīng)過大量臨床試驗證明，它具有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微量元素濃度的作用。它可由金屬、糖皮質(zhì)激素、某些毒物、細胞因子以及應激因素誘導合成。已有研究結(jié)果表明[2～5]，MT的誘導作用主要是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平來實現(xiàn)的。金屬離子誘導MT合成的能力極強，給實驗動物ip鎘時，其肝、腎、脾、腸等器官內(nèi)MT的含量均增加。MT的濃度增加有時可達40倍，不同金屬離子在不同組織中誘導MT合成的能力不同：在肝臟中鎘和鋅是最好的誘導劑，高濃度銅誘導效果也較好，汞則最弱；在腎臟中鎘最好，鋅則需高濃度，汞次之，銅最弱；已知的誘導金屬元素有銅、銀、金、鋅、鎘等。MT的產(chǎn)生與動物體內(nèi)重金屬的富集在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)平行關(guān)系，它可直接反映重金屬在動物體內(nèi)富集的部位和濃度。

圖1 HE染色Fig 1 HE staining

本研究通過MT與特異性的一抗相結(jié)合，產(chǎn)生抗體，再與二抗反應以及一系列顯色反應，在顯微鏡下清晰表達了MT在參環(huán)毛蚓體內(nèi)的分布。免疫組化觀察表明，MT主要在參環(huán)毛蚓的腸道中表達，雖然在其表皮中有類似于MT表達的棕黃色顆粒，但是在其空白對照組的試驗和HE染色中，均有此類似的棕黃色細胞，說明它不是MT的表達，而是參環(huán)毛蚓本身的色素細胞所形成的黑色素，這與Morgan AJ等[6]和Stürzenbaum SR等[7]研究粉蚯蚓的結(jié)果一致。由于參環(huán)毛蚓表皮的角質(zhì)層是高滲透性的，可能有少量的重金屬通過被動擴散進入體表，但是在其表皮層和肌肉層均未發(fā)現(xiàn)明顯的MT表達，而在其腸道的黏膜下腺細胞質(zhì)均有明顯的棕黃色顆粒，且隨著鎘濃度的增加，MT的表達越來越強，說明參環(huán)毛蚓對重金屬的富集是通過其黏膜下層腸上皮細胞來完成的。這為進一步研究參環(huán)毛蚓對重金屬的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及重金屬的解除提供了依據(jù)。

圖2 免疫組化圖片F(xiàn)ig 2 Immunohistochemistry photography

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