王 炯，周小菊，胡先明（.武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 43007；2.武漢遠(yuǎn)大弘元股份有限公司，武漢430070）

甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA）系甘草的主要成分甘草酸加水分解而來(lái)，也是甘草酸體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物[1]，是一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物。GA又稱(chēng)甘草亭酸，分子式為C30H46O4，白色針狀晶體，熔點(diǎn)289～291℃?，F(xiàn)代研究表明，GA除具有抗炎、抗?jié)?、抗過(guò)敏、抗病毒、降血脂、止咳、平喘、止痛等作用外，還具有抗腫瘤增生的作用[2，3]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，GA對(duì)鼠肝細(xì)胞癌、艾氏腹水癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、人乳腺癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人白血病細(xì)胞、艾滋病病毒等均有顯著的抑制作用[4～7]。由于GA為水不溶性化合物，口服后體內(nèi)吸收差，生物利用度低，且個(gè)體差異性大，故開(kāi)發(fā)GA的靶向制劑用于癌癥的治療已引起了廣大醫(yī)藥工作者的廣泛關(guān)注。

固體脂質(zhì)納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)新型給藥系統(tǒng)，它是將藥物包載于類(lèi)脂核中形成的粒徑在50～1000nm之間的膠體給藥系統(tǒng)。SLN具有穩(wěn)定性好、藥物載藥量高，同時(shí)又具有脂質(zhì)體的毒性低，能大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[8]。為了延長(zhǎng)納米粒在體內(nèi)的作用時(shí)間，通?？梢詫?duì)納米粒進(jìn)行聚乙二醇（PEG）修飾，增加其表面親水性，形成立體位阻，使納米粒躲過(guò)單核巨噬細(xì)胞系（MPS）的識(shí)別，使其在血液循環(huán)中滯留時(shí)間延長(zhǎng)[9]。長(zhǎng)循環(huán)固體脂質(zhì)納米粒（Long circulating solid lipid nanoparticles，LSLN）可起到緩釋、靶向、提高GA生物利用度等作用。本研究選用甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺（mPEG-DSPE）對(duì)SLN進(jìn)行PEG修飾，制備GA的長(zhǎng)循環(huán)固體脂質(zhì)納米粒（GA-LSLN），并對(duì)其理化性質(zhì)、體外釋放性能和細(xì)胞毒性進(jìn)行考察。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AR2130型電子天平（沈陽(yáng)杰龍儀器有限公司）；DF-101 S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；AH110 D型高壓勻質(zhì)機(jī)（加拿大ATS工業(yè)系統(tǒng)公司）；高效液相色譜（HPLC）儀（大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司）；BI-200 SM型動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布/Zeta電位測(cè)定儀（美國(guó)Brookhaven公司）；Sunrise型酶標(biāo)儀（澳大利亞Tecan公司）。

1.2 試藥

GA原料藥（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；GA對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110723-200612）；地塞米松注射液（DEXA，上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：101109）；硬脂酸（西安悅來(lái)醫(yī)藥科技有限公司）；大豆磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司）；泊絡(luò)沙姆188（德國(guó)BASF公司）；mPEG-DSPE（日本油脂株式會(huì)社）；水（二次重蒸水，筆者自制）；epharose CL-4 B凝膠柱（英國(guó)GE healthcare集團(tuán)）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯和N，N-二甲基甲酰胺為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

肝癌SK-Hep-1細(xì)胞系和急性髓細(xì)胞白血病MV 4-11細(xì)胞系，用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 GA-LSLN的制備

稱(chēng)取適量大豆磷脂、硬脂酸、mPEG-DSPE和GA，加入少量乙醇使其溶解，在攪拌狀態(tài)下將有機(jī)相注入至60℃水相中，充分?jǐn)嚢?0 min，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)一步揮發(fā)有機(jī)溶劑，經(jīng)過(guò)高壓勻質(zhì)機(jī)循環(huán)勻質(zhì)3～5次后，室溫放冷，過(guò)0.45μm濾膜，即得GA-LSLN膠體溶液，該膠體溶液呈半透明狀、有藍(lán)色乳光；同時(shí)按相同方法制備空白LSLN膠體溶液。

2.2 GA-LSLN形態(tài)、粒徑、表面電位的測(cè)定

取少量GA-LSLN膠體溶液，以蒸餾水稀釋至適宜濃度，吸取2滴，用2%磷鎢酸鈉負(fù)染，以透射電鏡觀察其形態(tài)及分布；用粒度測(cè)定儀測(cè)定納米粒粒徑大小，用Zeta電位測(cè)定儀測(cè)定其Zeta電位。結(jié)果顯示，GA-LSLN粒徑大小均勻，平均粒徑為130.1 nm，Zeta電位為－36.2 mV。GA-LSLN透射電鏡見(jiàn)圖1；GA-LSLN粒徑分布見(jiàn)圖2。

2.3 含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 GA含量測(cè)定方法

參考有關(guān)文獻(xiàn)[10]，選用HPLC法測(cè)定GA含量。色譜條件：色譜柱為ODS C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸（89∶10∶1），流速為1 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量為20μL。

2.3.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取處方量配比的空白LSLN、GA-LSLN和GA對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解后按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，SLN輔料對(duì)GA含量測(cè)定無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖3。

圖1 GA-LSLN透射電鏡圖Fig 1TEM of GA-LSLN

圖2 GA-LSLN粒徑分布圖Fig 2 Distribution of particle size of GA-LSLN

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密稱(chēng)取GA對(duì)照品適量，以1.0%NH3·H2O-甲醛（2∶8）溶液先制備成1 mg·mL－1的GA貯備液。精密吸取GA貯備液，以1.0%NH3·H2O-甲醛（2∶8）溶液制備成濃度為1、2、10、20、40、80μg·mL－1的溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各濃度下溶液的峰面積。以GA濃度（c）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為Y＝67006c+7762.7（r＝0.9996）。結(jié)果表明，GA濃度在1～80μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線(xiàn)性關(guān)系。檢測(cè)限（信號(hào)S和噪聲N的比值（S/N）＝3）為0.01μg·mL－1。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密量取GA貯備液2、40、80 μL，分別置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制備成2、40、80 μg·mL－1的低、中、高濃度溶液，每個(gè)濃度分別進(jìn)樣5次。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度（5 d）。結(jié)果，日內(nèi)RSD分別為1.07%、0.59%、0.41%（n均為5），日間RSD分別為2.51%、0.74%、0.54%（n均為5），表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取自制同一批GA-LSLN適量，共6份，分別置于100mL容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，RSD為0.25%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取自制同一批GA-LSLN適量，共3份，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，制備成2、40、80 μg·mL－1的低、中、高濃度溶液，于4℃貯藏。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定1、2、4、6、10、14、22、30d后的峰面積。結(jié)果，低、中、高濃度的RSD分別為1.03%、0.78%、0.81%（n均為8），表明GA-LSLN在4℃下30 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取空白LSLN溶液1 mL，共9份，分別置于10 mL量瓶中，分別精密加入濃度為1 mg·mL－1的貯備液，加流動(dòng)相稀釋至刻度。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為（99.72±0.24）%（n＝9）。

2.4 包封率、載藥量與體外釋放度的測(cè)定

2.4.1 包封率與載藥量的測(cè)定 取適量GA-LSLN膠體溶液，過(guò)sepharose CL-4 B凝膠柱，以蒸餾水為洗脫液，分離出GA-LSLN和游離GA，用試管收集不同時(shí)間段的洗脫液，每管1 mL，收集15份，洗脫液用適量的乙醇稀釋后，測(cè)定每份洗脫液中GA的峰面積積分值。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線(xiàn)。包封率按下式計(jì)算：包封率＝AUCGA-LSLN/（AUCGA-LSLN+AUCfree-GA）×100%（式中，AUCGA-LSLN為洗脫曲線(xiàn)中GA-LSLN中GA曲線(xiàn)下面積；AUCfree-GA為洗脫曲線(xiàn)中游離GA的曲線(xiàn)下面積）。另精密量取1 mL的GA-LSLN膠體溶液，用甲醇破乳并稀釋?zhuān)瑴y(cè)定GA含量，按下式計(jì)算載藥量：載藥量＝MGA/Mlipid×100%（式中，MGA為GA-LSLN中GA的量；Mlipid為GA-LSLN中脂質(zhì)的量）。結(jié)果，GA-LSLN的包封率為94.6%，載藥量為11.3%。GA-LSLN和游離GA的洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖4（在第8 mL收集液中GA含量為零，即8 mL為分界點(diǎn)，前為GA-LSLN峰，后為游離GA峰）。

圖4 GA-LSLN和游離GA的洗脫曲線(xiàn)Fig 4 Separation curves of GA-LSLN and free GA

2.4.2 體外釋放度的測(cè)定 以200 mL含0.5%的十二烷基硫酸鈉和30%乙醇的pH 7.4的PBS溶液為介質(zhì)[11]，精密移取2 mL GA-LSLN膠體溶液，置于透析袋中（截留分子量8000），磁力攪拌。分別于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0、48.0 h取釋放液0.5 mL，過(guò)0.45μm的微孔濾膜，進(jìn)行HPLC分析，同時(shí)補(bǔ)充同溫度的溶出介質(zhì)1 mL。測(cè)定GA濃度，按下式計(jì)算累積釋放百分率（Q）：Q（%）＝Ct/C0×100%（式中，Ct為釋放的藥物量；C0為脂質(zhì)體中初始藥物量）。以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，Q為縱坐標(biāo)，繪制體外釋藥曲線(xiàn)。將所得數(shù)據(jù)與一級(jí)、Higuchi、Weibull方程進(jìn)行擬合。結(jié)果表明，其釋放規(guī)律更符合一級(jí)速率過(guò)程。GA-LSLN體外釋藥曲線(xiàn)見(jiàn)圖5；體外釋藥曲線(xiàn)回歸方程擬合見(jiàn)表1。

圖5 GA-LSLN體外釋藥曲線(xiàn)Fig 5 Drug release curves of GA-LSLN in ritro

表1 體外釋藥曲線(xiàn)回歸方程擬合Tab 1 Fitted regression equation of drug release curves

2.5 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SK-Hep-1肝癌細(xì)胞，以0.5×104個(gè)/L種植于96孔板；白血病細(xì)胞MV4-11，以1×105個(gè)/L種植于96孔板，選用游離藥物DEXA為陽(yáng)性對(duì)照，將DEXA、GA和GA-LSLN按1∶4的倍數(shù)稀釋成一系列濃度，加入種植了癌細(xì)胞的96孔板中，各種條件平行做5孔，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入20μL 5 mg·mL－1的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜200μL，振蕩，充分溶解，置于酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度對(duì)數(shù)值對(duì)細(xì)胞存活率作圖，計(jì)算各樣品對(duì)肝癌細(xì)胞SK-HEP-1和白血病細(xì)胞MV4-11的半數(shù)抑制濃度（IC50）。GA-LSLN、游離GA和DEXA對(duì)SK-Hep-1和MV4-11細(xì)胞的IC50值見(jiàn)表2。

3 討論

表2 GA-SLN、游離GA和DEXA對(duì)SK-Hep-1和MV4-11細(xì)胞的IC50值（μmol·L－1，n＝5）Tab 2 IC50of GA-SLN，free GA and DEX to SK-Hep-1 and MV 4-11（μmol·L－1，n＝5）

因文獻(xiàn)報(bào)道在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞上存在GA受體，GA的趨肝性和肝靶向性引起了醫(yī)藥工作者的高度關(guān)注，人們將目光紛紛轉(zhuǎn)向于以GA修飾的脂質(zhì)體和納米粒作為肝靶向載體材料的研究[12]。GA本身作為一種抗腫瘤藥物，在中藥復(fù)方制劑中一直被廣泛應(yīng)用于臨床，但開(kāi)發(fā)新型GA靶向制劑，在抗癌藥物制劑領(lǐng)域仍然具有誘人的前景。

本研究采用乳化溶劑揮發(fā)-高壓勻質(zhì)法制備GA-LSLN，該工藝簡(jiǎn)單、可行，所制得的SLN粒徑適宜且大小均勻。本處方中加入mPEG-DSPE，不僅可以增加納米粒的穩(wěn)定性，而且因納米粒表面具有PEG鏈，使其更具有長(zhǎng)循環(huán)功能。

GA為脂溶性藥物，在pH7.4的PBS中溶解度較小，因此在選擇透析介質(zhì)時(shí)使用了0.5%的十二烷基硫酸鈉和30%乙醇，以保證一個(gè)處方量的GA能完全溶解，同時(shí)又不會(huì)造成GA在平衡時(shí)間內(nèi)從SLN中滲漏。體外釋放曲線(xiàn)符合一級(jí)速率過(guò)程，說(shuō)明藥物主要以被動(dòng)擴(kuò)散的形式從SLN中釋放到溶出介質(zhì)。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)選用DEXA作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，是因?yàn)镚A的化學(xué)結(jié)構(gòu)與甾體激素類(lèi)藥物DEXA相似，同時(shí)DEXA也被用于肝癌和急性白血病的治療[13，14]。研究表明，GA和GA-LSLN對(duì)肝癌細(xì)胞SK-Hep-1和急性髓細(xì)胞白血病MV 4-11具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而GA-LSLN對(duì)這2種細(xì)胞的IC50均比游離GA大，說(shuō)明其細(xì)胞毒性比游離藥物小，其主要原因是因?yàn)镚A從GA-LSLN中緩慢釋放，在相同時(shí)間內(nèi)，GA-LSLN中與細(xì)胞接觸的游離GA濃度低。該制劑對(duì)肝癌和急性白血病的治療作用有待進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)活性研究。

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