趙秀梅，張富賡，沈洪昇，史鵬程，胡人杰#（.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 30000；.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300060）

牛蒡（Arctium lappa L.），別名惡實(shí)根，屬于菊科牛蒡?qū)?年生草本植物[1]。牛蒡根為牛蒡的根，主要作為蔬菜或制成保健品廣為食用。目前，對(duì)牛蒡根的研究主要集中在抗菌、降血糖、抗衰老及其抗突變方面[2，3]，其抗腫瘤活性方面的研究幾乎是空白。筆者采用系統(tǒng)溶劑提取法對(duì)牛蒡根進(jìn)行提取和初步分離，選擇人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人胃腺癌細(xì)胞BGC-823、小鼠肝癌細(xì)胞HepA、小鼠肉瘤細(xì)胞S180和小鼠脾淋巴細(xì)胞為觀察對(duì)象，對(duì)不同極性提取物的生物活性進(jìn)行初步觀察、比較，探討牛蒡根的進(jìn)一步研發(fā)價(jià)值。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2孵育箱（美國(guó)Revco公司）；Infinite M200 PRO型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；96孔板（德國(guó)Greinerbio公司）。

1.2 試藥

牛蒡根為市售品，由天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳研究員鑒定為真品；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；MTT、刀豆蛋白A（Con A）均購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，天津瑞金特化學(xué)品有限公司）；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇（天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司）。

1.3 動(dòng)物與細(xì)胞株

昆明種小鼠，♀♂兼用，體重18～20 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2006-2008）。

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823、小鼠肝癌腹水型細(xì)胞株HepA和小鼠肉瘤腹水型細(xì)胞株S180均由天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所細(xì)胞室提供。

2 方法

2.1 樣品的制備

取牛蒡根干燥粗粉適量，乙醇回流提取3次，合并醇提液，減壓回收溶劑，浸膏加適量水成混懸液，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。將各萃取液分別濃縮，得石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層。用前以含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制并進(jìn)行倍量稀釋。

2.2 樣品對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[4]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7和BGC-823細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，以每孔100 μL分別接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁。另外再抽取HepA和S180細(xì)胞小鼠腹水，PBS洗滌2次，用含10%小牛血清的RPMI 1640液稀釋成1×106個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。

于上述96孔板中加入不同濃度的待測(cè)樣品液100 μL，每個(gè)濃度平行4孔。以加入等體積含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，使反應(yīng)體積為200 μL為對(duì)照。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入5 mg·mL－1MTT液10 μL，37℃溫育4 h，1000 r·min－1離心10 min，小心吸去上清液，每孔加人180 μL DMSO，震蕩，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（A）值。藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）用SPSS13.0軟件進(jìn)行計(jì)算。按下式計(jì)算藥物各個(gè)濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率（IR）：IR（%）＝（1－樣品平均A值/對(duì)照平均A值）×100%。

2.3 樣品對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響[5]

小鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下摘取脾臟，收集脾細(xì)胞。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至4×106個(gè)/mL。以每孔75μL加于96孔板中，再加入20μg·mL－1Con A溶液25 μL，其余步驟如復(fù)孔、對(duì)照孔的設(shè)置，待測(cè)樣品的加入，細(xì)胞的培養(yǎng)以及MTT的加入，均按“2.2”項(xiàng)下方法操作，并測(cè)定A值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 牛蒡根提取物對(duì)體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

3.1.1 牛蒡根提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞、BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照組比較，牛蒡根石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物對(duì)MCF-7和BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出一定的抑制作用。對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50分別為（213.43±104.38）、（276.42±87.85）、（235.67±189.48）μg·mL－1；對(duì)BGC-823細(xì)胞的 IC50分別為（380.83±62.64）、（336.21±44.11）、（564.65±84.85）μg·mL－1。牛蒡根提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用由強(qiáng)到弱為：石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物；牛蒡根提取物對(duì)BGC-826細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用由強(qiáng)到弱為：氯仿提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物。正丁醇提取物在測(cè)試的濃度范圍內(nèi)對(duì)MCF-7和BGC-823細(xì)胞沒(méi)有顯示出細(xì)胞毒活性。牛蒡根提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞、BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)的影響分別見表1、表2。

表1 牛蒡根提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（n＝4）Tab 1 The effect ofA.lappa root extracts on the proliferation of MCF-7cells（n＝4）

表2 牛蒡根提取物對(duì)BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（n＝4）Tab 2 The effect ofA.lappa root extracts on the proliferation of BGC-823cells（n＝4）

3.1.2 牛蒡根提取物對(duì)HepA細(xì)胞、S180細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 牛蒡根石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物在各濃度范圍內(nèi)對(duì)小鼠HepA、S180細(xì)胞均表現(xiàn)出不同程度的生長(zhǎng)抑制作用，量效關(guān)系基本明確。各提取物對(duì)HepA細(xì)胞的IC50分別為（56.12±21.47）、（52.85±19.41）、（49.52±36.56）、（84.13±36.69）μg·mL－1；對(duì)S180細(xì)胞的IC50分別為（7.34±1.65）、（5.36±0.76）、（64.14±12.63）、（33.29±12.14）μg·mL－1。牛蒡根提取物對(duì)HepA細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用由強(qiáng)到弱為：乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物；牛蒡根提取物對(duì)S180細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用由強(qiáng)到弱為：氯仿提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物。牛蒡根提取物對(duì)HepA細(xì)胞、S180細(xì)胞生長(zhǎng)的影響分別見表3、表4。

3.2 牛蒡根提取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

4種提取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞（主要是T淋巴細(xì)胞）的增殖表現(xiàn)出了明確的抑制作用，這種作用基本上呈劑量依賴性。牛蒡根石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物對(duì)淋巴細(xì)胞增殖抑制的 IC50分別為（22.22±4.90）、（32.15±3.45）、（31.66±10.65）、（126.45±47.32）μg·mL－1。牛蒡根提取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用由強(qiáng)到弱為：石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物。牛蒡根提取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響見表5。

4 討論

表3 牛蒡根提取物對(duì)HepA細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（n＝4）Tab 3 The effect ofA.lappa root extracts on the proliferation of HepAcells（n＝4）

表4 牛蒡根提取物對(duì)S180細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（n＝4）Tab 4 The effect of A.lappa root extracts on the proliferation of S180cells（n＝4）

表5 牛蒡根提取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響（n＝4）Tab 5 The effect of A.lappa root extracts on the proliferation of mice spleens lymphocytes（n＝4）

人們對(duì)于牛蒡的研究主要集中于其法定的藥用部位牛蒡子，并已證明其化學(xué)成分牛蒡苷具有抗腫瘤活性。牛蒡的非藥用部位牛蒡根作為食品在日本、韓國(guó)以及我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)受到推崇。

本研究發(fā)現(xiàn)，牛蒡根4種不同極性提取物中石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物對(duì)體外培養(yǎng)的HepA、S180、MCF-7、BGC-823細(xì)胞均表現(xiàn)出明確的生長(zhǎng)抑制作用。筆者首次確定了牛蒡根的體外抗腫瘤作用。但研究結(jié)果也顯示，MCF-7、BGC-823細(xì)胞對(duì)樣品的IC50值明顯高于HepA、S180細(xì)胞，這可能是由于作為懸浮生長(zhǎng)小鼠的腫瘤細(xì)胞比貼壁生長(zhǎng)的人腫瘤細(xì)胞對(duì)樣品有更高的敏感度，而且從體積上來(lái)講，小鼠的腫瘤細(xì)胞也要小于貼壁細(xì)胞。研究中筆者還發(fā)現(xiàn)，所有樣品對(duì)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出明確的抑制作用，表明牛蒡根的抗腫瘤作用機(jī)制與增強(qiáng)細(xì)胞的免疫活性無(wú)關(guān)。以上研究結(jié)果均表明牛蒡根提取物確有細(xì)胞毒活性。此外，在另一研究中筆者對(duì)牛蒡根和牛蒡子進(jìn)行了初步的成分分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛蒡根中不含有牛蒡子中特有的抗腫瘤活性成分牛蒡苷，說(shuō)明牛蒡根中的抗腫瘤活性成分很可能不同于牛蒡子。以往研究證實(shí)，菊科植物中含有炔類化合物[6]。20世紀(jì)60年代，日本學(xué)者從牛蒡根中分離得到了炔類化合物，并證實(shí)其具有抗菌活性，而近年來(lái)的研究表明，炔類化合物很可能具有抗腫瘤的生物活性[7]。本研究中牛蒡根的抗腫瘤生物活性，是否與其所含的“炔類化合物”相關(guān)，有待進(jìn)一步考察，筆者認(rèn)為開發(fā)牛蒡根作為抗腫瘤的藥物或食品具有一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)于牛蒡根提取物中有關(guān)“活性成分”的分離和藥理學(xué)評(píng)價(jià)尚在進(jìn)行中，期望得到良好的結(jié)果。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：60.

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