胡澤麗，程國(guó)華，龐廷媛，陳 娟，汪小樂（廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院藥劑科，廣州 510095）

漢防己甲素（Tetrandine，TET）是從防己科植物的干燥塊根中提取出來的一種雙芐基異喹啉類生物堿，有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、解痙、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗?jié)兊人幚碜饔谩ＥR床上TET對(duì)矽肺、風(fēng)濕痛有一定療效，常與低劑量放射合并治療肺癌，為放射治療腫瘤增效藥物[1]。TET iv有局部刺激性，而以無毒可生物降解的聚乳酸為載體，制成肺靶向制劑能提高肺部藥物濃度，減輕局部刺激性和全身毒副作用。因此，以聚乳酸為載體，采用液中干燥法制備肺靶向微球平均粒徑為80.3%，載藥量為46.9%[2]，同法制備聚乳酸空白微球（PLA-MC）。為評(píng)價(jià)TET聚乳酸微球（TET-MC）的安全性，筆者按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）2005年頒布編號(hào)為[H]GDT4-1“化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則”的要求進(jìn)行制劑安全性的評(píng)價(jià)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RW20 DZM.n型強(qiáng)力流線型攪拌機(jī)（德國(guó)IKA公司）；5810型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；TC-120型智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、TB-718型生物組織自動(dòng)包埋機(jī)（孝感市泰維電子設(shè)備有限公司）；HM450型電腦程控式切片機(jī)（德國(guó)Microm GmbH公司）；CFM-500型倒置熒光顯微鏡攝像系統(tǒng)（德國(guó)Zeiss公司）。

1.2 試藥

TET原料藥（西安山川生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20100409）；TET注射液（江西銀濤藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20053840）；聚乳酸（濟(jì)南岱罡生物科技有限公司，分子量：10000）；TET-MC（載藥量：46.9%，批號(hào)：20110415）、PLA-MC（批號(hào)：20110507）、卵白蛋白均為筆者自制；弗氏完全佐劑（美國(guó)Sigma公司，規(guī)格：F5881-10 mL）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠150只，♀♂兼半，體重18～22 g；新西蘭兔18只，♀♂兼半，體重2.0～2.5 kg；SD大鼠32只，♀♂兼半，220～240 g，以上動(dòng)物均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002）。

2 方法[3]與結(jié)果

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

以生理鹽水為分散介質(zhì)配制供試樣品。實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)大組，每組設(shè)定5個(gè)劑量，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將TET注射液①、②、③、④、⑤（65.00、52.00、41.60、33.28、26.24mg·kg－1）組、PLA-MC①、②、③、④、⑤（800.00、640.00、512.00、409.60、327.68 mg·kg－1）組、TET-MC①、②、③、④、⑤（250.00、200.00、160.00、128.00、102.40 mg·kg－1）組劑量間距調(diào)整為0.8。取禁食12 h昆明種小鼠150只，按體重、性別隨機(jī)均分為15組，分別尾iv相應(yīng)藥物。給藥后連續(xù)觀察6 h，如無異常則終止持續(xù)觀察，改為每天觀察1次，觀察至給藥后第14天。記錄各組小鼠的死亡情況、體重變化。對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中因?yàn)l死而處死的小鼠、死亡的小鼠和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍存活的小鼠均進(jìn)行大體解剖，觀察主要臟器變化，變化若有異常均記錄并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。采用Bliss法計(jì)算小鼠的半數(shù)致死量（LD50）與95%可信限。小鼠尾iv高劑量（65 mg·kg－1）TET注射液，小鼠立即出現(xiàn)躁動(dòng)不安，呼吸困難，驚厥、抽搐死亡，死亡多發(fā)生于5 min內(nèi)，其它劑量組小鼠部分抽搐死亡，未死亡的小鼠14 d后仍活動(dòng)正常；尾iv高劑量TET-MC（800mg·kg－1）、PLA-MC（250mg·kg－1）后，小鼠立即呼吸困難、死亡，其它劑量組部分小鼠呼吸急促后死亡，部分小鼠數(shù)分鐘后緩解，14 d后仍活動(dòng)正常。死亡小鼠經(jīng)解剖，肉眼觀察肺部有瘀血，其余器官未見明顯變化。小鼠一次性尾iv藥物后的LD50測(cè)定結(jié)果見表1。

2.2 血管刺激性實(shí)驗(yàn)

表1 小鼠一次性iv藥物后的LD50測(cè)定結(jié)果Tab 1 The LD50level of different drugs in mice after one time intravenous administration

新西蘭兔12只，隨機(jī)分為2組，每組6只，采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，觀察血管刺激性。第1組左耳iv TET-MC混懸液（8 mg·kg－1），右耳iv等容生理鹽水作為陰性對(duì)照；第2組左耳iv TET注射液（8 mg·kg－1），右耳iv等容生理鹽水作為陰性對(duì)照。給藥體積1 mL，每天1次，連續(xù)3 d，每天給藥前和末次給藥后48 h對(duì)兔和注射部位進(jìn)行肉眼觀察，觀察結(jié)束后每組各處死一半兔，于注射處1 cm左右取一段血管，立即放入10%的甲醛溶液中固定，進(jìn)行常規(guī)病理組織學(xué)檢查。留存一半兔繼續(xù)進(jìn)行14 d的恢復(fù)期觀察，觀察期結(jié)束后按同樣的方法處死、取材進(jìn)行組織學(xué)檢查。各組給藥后，除由注射操作原因引起的紅腫外，局部血管注射部位均無明顯充血、腫脹等現(xiàn)象。病理組織切片顯示，新西蘭兔耳緣iv部位未見損傷性病變，靜脈管壁完整，未見炎癥反應(yīng)等病變，表明TET注射液和TET-MC在實(shí)驗(yàn)劑量下無明顯的血管刺激性。耳緣靜脈病理組織切片見圖1。

圖1 耳緣靜脈病理組織切片圖（100×）Fig 1 Pathohistological photograph of ear vein（100×）

2.3 肌肉刺激性實(shí)驗(yàn)

新西蘭兔6只，采用自體左右側(cè)對(duì)比法，觀察肌肉刺激性。第1組左腿股四頭肌im TET注射液（8 mg·kg－1），右腿股四頭肌im等容生理鹽水作陰性對(duì)照；第2組左腿股四頭肌im TET-MC混懸液（8 mg·kg－1），右腿股四頭肌im等容生理鹽水作為陰性對(duì)照。給藥體積1 mL，每天1次，連續(xù)3 d。注射后觀察新西蘭兔狀態(tài)，14 d后解剖取出股四頭肌，縱向切開，觀察注射部位局部刺激反應(yīng)及可逆反應(yīng)的程度，取材進(jìn)行組織學(xué)檢查。病理組織切片顯示，給藥14 d后陰性對(duì)照組兔肌肉組織正常，未見炎癥損傷；TET注射液組有炎癥反應(yīng)及肌肉組織纖維化；TET-MC組可見微球分布于肌肉中，微球周圍有炎癥反應(yīng)，肌纖維有沖斷的現(xiàn)象，表明TET注射液、TET-MC都有一定的肌肉刺激性。肌肉組織病理切片見圖2。

圖2 肌肉組織病理切片圖（14d，100×）Fig 2 Pathohistological photograph of muscular（14d，100×）

2.4 被動(dòng)皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)（PCA）

SD大鼠8只，均分為4組，分別為陰性對(duì)照（生理鹽水）、陽性對(duì)照（卵白蛋白）和TET-MC高、低劑量（30、10mg·kg－1）組。每組定時(shí)、無菌、間日sc供試液1 mL，共3次，ip弗氏完全佐劑0.5mL/只，末次致敏后10d心臟采血，2000r·min－1離心10 min－1，分離血清，－20℃貯藏，備用。

另取相應(yīng)大鼠，分組同上，每組6只，♀♂各半，乙醚淺麻醉，背部預(yù)先脫毛4點(diǎn)（脊柱兩側(cè)），每點(diǎn)面積約為3×4 cm2，同時(shí)配制各組血清iv生理鹽水稀釋液（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16），備用。每只大鼠于脫毛處某一點(diǎn)sc 0.1 mL一種上述血清。被動(dòng)致敏24 h后，各組iv與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量0.5%伊文思藍(lán)染料共1 mL，進(jìn)行激發(fā)。30 min后麻醉處死各組大鼠，剪取背部皮膚，測(cè)量皮膚內(nèi)層的斑點(diǎn)大小，直徑＞5 mm者判斷為陽性。不規(guī)則斑點(diǎn)的直徑為長(zhǎng)徑與短徑之和的一半。

結(jié)果，陽性對(duì)照組藍(lán)斑直徑均＞5 mm，TET-MC高、低劑量和生理鹽水組藍(lán)斑直徑均＜5 mm，表明被動(dòng)皮膚過敏結(jié)果為陰性。SD大鼠PCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

4 討論

采用液中干燥法制備TET-MC，粒徑為7～15μm的占80.3%。研究表明[4]，TET-MC菌檢合格，在室溫條件下穩(wěn)定性良好。小鼠尾iv TET注射液，LD50為41.6 mg·kg－1，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道33.30 mg·kg－1接近，說明本方法可行，TET微球化后LD50提高，毒性明顯降低。

表2 SD大鼠PCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Results of PCAtest of SD rats（±s，n＝6）

表2 SD大鼠PCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Results of PCAtest of SD rats（±s，n＝6）

組別陰性對(duì)照組陽性對(duì)照組TET-MC低劑量組TET-MC高劑量組致敏鼠數(shù)/n 6666陽性反應(yīng)鼠數(shù)（藍(lán)斑直徑）/只（mm）1∶20（1.0±0.3）6（26.0±3.2）0（1.0±0.7）0（1.0±0.6）1∶40（1.0±0.1）6（18.0±2.1）0（0.6±0.2）0（1.0±0.2）1∶806（14.4±2.3）001∶1606（10.0±1.8）00

TET臨床iv劑量為2.85～4.29 mg·kg－1，血管刺激性預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)按2.85 mg·kg－1劑量換算成新西蘭兔給藥劑量14 mg·kg－1給藥，給藥后出現(xiàn)兔立即死亡的現(xiàn)象，最后采用8 mg·kg－1的給藥劑量。

iv 7～12μm的微球通常被肺毛細(xì)血管以機(jī)械濾過方式截留，集中于肺部表現(xiàn)肺部靶向性。在進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，TET-MC高劑量（250 mg·kg－1）組小鼠迅速死亡，病理解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)肺部有瘀血。導(dǎo)致死亡的原因可能有：TET-MC混懸液在貯藏期間容易發(fā)生聚集、融合及藥物滲漏，導(dǎo)致微球抱成團(tuán)粒徑增大，小鼠腦部或血管栓塞死亡；一次性注射微球過多，大量集中于肺部導(dǎo)致局部栓塞。提示TET-MC應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前盡量混勻，同時(shí)應(yīng)該提高載藥量，減少微球用量。肌肉刺激性實(shí)驗(yàn)中TET-MC混懸液有炎癥反應(yīng)，可能的原因是聚乳酸的降解是一個(gè)復(fù)雜的過程，聚乳酸的降解過程中局部酸性積累導(dǎo)致聚乳酸存在部位出現(xiàn)非感染性炎癥，甚至局部嚴(yán)重水腫[6]。

總之，對(duì)TET-MC的安全性研究結(jié)果表明，小鼠尾iv TET-MC混懸液LD50為158.9 mg·kg－1，該微球制劑無溶血性，未見血管刺激性，有輕微的肌肉刺激性，未產(chǎn)生過敏反應(yīng)，在本實(shí)驗(yàn)條件下TET-MC基本安全。

[1]陳志蓉.漢防己甲素的臨床應(yīng)用概述[J].海峽藥學(xué)，2008，20（8）：119.

[2]程國(guó)華，王 娟.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化漢防己甲素肺靶向微球的處方及制備工藝[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23（7）：390.

[3]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（第二稿）[Z].2005.

[4]程國(guó)華，羅佳波.漢防己甲素微球的穩(wěn)定性研究[J].中藥材，2005，28（5）：429.

[5]李鳳前，陸 彬，陳文彬.肺靶向漢防己甲素緩釋微囊的安全性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2002，19（6）：478.

[6]Bergsma JE，Rozema FR，Bos RR，et al.Foreign-body reactions to resorbable poly-（l-lactide）bone plates and screws used for the fixation of unstable zygomatic fractures[J].J Oral Maxillo fac Surg，1993，51（6）：666.