王國(guó)峰，尹魯平，趙 霞，陳冬梅

(1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院干部病房三科，山東 濟(jì)南 250031;2.中國(guó)科學(xué)院生物物理所腦與認(rèn)知科學(xué)中心，北京 100101)

腦卒中(stroke)是以局灶性神經(jīng)功能缺失為共同特征，或伴發(fā)意識(shí)障礙的急性腦血管疾病。缺血性腦卒中(ischemic stroke)是最常見腦卒中類型，有關(guān)腦缺血病理機(jī)制的學(xué)說眾多，如興奮性氨基酸釋放增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、代謝性酸中毒等，但據(jù)此采取的治療措施均不能獲得理想療效，尚缺乏有效的治療藥物。

芍藥苷(paeoniflorn，PAE)是傳統(tǒng)中藥處方芍藥根的主要成分，具有抗氧化、增強(qiáng)認(rèn)知功能及內(nèi)皮依賴性舒張血管等藥理活性［1－3］。既往研究表明，PAE可通過激活腺苷Al受體，并抑制與之偶聯(lián)的MAPK通路，阻斷花生四烯酸通路炎癥蛋白COX-2和5-LOX在腦缺血中過度表達(dá)，模擬缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IPC)誘導(dǎo)藥理預(yù)適應(yīng)發(fā)揮延遲神經(jīng)保護(hù)作用［4］。

本文在上述基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究PAE對(duì)腦缺血的治療作用及其對(duì)M受體信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，旨在為腦卒中的治療提供新靶點(diǎn)、新策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康♂大鼠(Sprague-Dawley，鼠齡60～90 d，體質(zhì)量220～250 g)由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SPF級(jí)，合格證書號(hào):SCXK(滬)2002-0010］。

1.2 藥品與試劑 PAE(純度98.5%):購于中國(guó)藥品與生物制品檢定所。2，3，7-三苯基氯化四氮唑(TTC)購自 Sigma(Aldrich，St Louis，USA);TRI-REAGENT-LS試劑盒購自 Molecular Research Center，Inc.(Cincinnati，USA);RNasin、dNTP、Oligo(dT)18引物和 DNA polymerase購自 Sangon Biotechnology Co.(Shanghai，China);M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購自 Fermentas，Inc.(Vilnius，Lithuania);DNA 熒光染 料SYBR Green I購自 Roche Co.(Mannheim，Germany);其它均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 ① 模型組:MCAO(90 min)，再灌注(24 h)，缺血同時(shí)給予生理鹽水(2 ml·kg－1，ip，14 days，每天兩次)，即從缺血計(jì)算為0時(shí)，大腦中動(dòng)脈梗死90 min后拔出絲線再灌24 h;于缺血0時(shí)給予生理鹽水，連續(xù)14 d;② PAE治療組:MCAO(90 min)，再灌注(24 h)，缺血同時(shí)給予PAE(2.5、5、10 mg·kg－1，ip，14 d，每天兩次);③ 假手術(shù)組。n=8。大鼠生理指征如血氧、血糖等于MCAO前、MCAO過程中及再灌后30 min分別測(cè)定，實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物體溫始終維持(37±1)℃。

1.4 大腦中動(dòng)脈梗死模型的建立 參考Takano模型［5］，采用可逆性大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞法造成局灶性腦缺血模型。以水合氯醛(300 mg·kg－1，ip)麻?醉大鼠，頸部切口，游離頸外動(dòng)脈，遠(yuǎn)端結(jié)扎。取頭端呈圓球狀4#尼龍線，由頸外動(dòng)脈根部經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈向前延伸，插入約20 mm，遇到阻力停止。栓塞90 min后拔出栓線，再灌注24 h。

1.5 神經(jīng)體征評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù) Sydserff等［6］神經(jīng)體征評(píng)分:無明顯體征(0分);將大鼠懸空觀察，其損傷對(duì)側(cè)前肢屈曲(1分);損傷對(duì)側(cè)據(jù)抗推力下降(2分);提尾向損傷的對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈但自由行走時(shí)不轉(zhuǎn)圈(3分);自發(fā)性向損傷對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈(4分)。

1.6 TTC染色后腦梗死體積的測(cè)定 將大鼠斷頭后，立即取出大腦，置－20℃約15 min，大腦作連續(xù)冠狀切片(片厚2 mm)。腦片置于1%TTC(pH 7.2)37℃孵育10 min染色，10%甲醛溶液固定。數(shù)碼相機(jī)拍照，測(cè)定腦梗死體積。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄－多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 采用RT-PCR技術(shù)對(duì)mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。再灌注24 h后分離皮層、海馬和紋狀體。TRIzol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中如下:3 μl(1 μg)總RNA提取液，2 μl 10 mmol·L－1dNTPs，1 μl(1.6 μg)Oligo(dT)18作為引物，1 μl(20 U)RNase抑制劑(Promega，USA)，1 μl(20 U)M-MuLA 反轉(zhuǎn)錄酶及 4 μl 5 ×buffer。反應(yīng)條件為:變性(94℃，30 s)，退火(68℃，30 s)，延伸(72℃，45 s)，共35個(gè)循環(huán)。以2%瓊脂糖電泳分離，溴乙啶染色后用凝膠分析儀觀察，以看家基因β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)光密度值。

2 結(jié)果

2.1 PAE對(duì)腦梗死體積及神經(jīng)功能缺陷的影響

PAE對(duì)腦缺血/再灌注損傷(I/R)的治療學(xué)作用如Fig 1 所示，PAE 在2.5、5 和10 mg·kg－1劑量14 d 治療后，腦梗死體積分別降低為模型組的0.64倍、0.5倍及0.48倍(P＜0.01);神經(jīng)功能評(píng)分分別降低為模型組的0.35倍、0.3倍和0.3倍(P＜0.01)。提示PAE對(duì)腦缺血/再灌注損傷具有良好治療學(xué)作用。

2.2 對(duì)M受體基因表達(dá)的影響 PAE對(duì)不同腦區(qū)I/R后M受體基因表達(dá)的影響如Fig 2所示。在皮層、海馬和紋狀體，PAE治療性給藥14 d后與模型組相比，使M1受體基因表達(dá)分別增加1.78倍、1.87倍和1.58倍(P＜0.01);使M3受體基因表達(dá)分別增加3.5倍、3.2倍和3.07倍(P＜0.01);使M5受體基因表達(dá)分別增加3.9倍、1.6倍和1.38倍(P＜0.01)。

Fig 1 Effects of PAE on the size of cerebral infarct measured by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining after transient MCAO followed by reperfusion(±s，n=8)

進(jìn)一步研究了PAE對(duì)突觸前M2和M4基因表達(dá)的影響。在皮層和海馬，PAE治療性給藥14 d后與模型組相比，使M2受體基因表達(dá)分別降低3.38倍和1.28倍(P＜0.01);在皮層、海馬和紋狀體，使M4受體基因表達(dá)分別增加2.05倍、1.55倍和1.23倍(P＜0.01)。

2.3 對(duì)G蛋白基因表達(dá)的影響 進(jìn)一步研究了I/R及PAE治療對(duì)與不同亞型M受體相偶聯(lián)的G蛋白基因表達(dá)影響(Fig 3)。在3個(gè)腦區(qū)，I/R可誘導(dǎo)與M2和M4相偶聯(lián)的Gi蛋白基因表達(dá)增高，PAE治療給藥14 d后抑制該病理性改變(P＜0.01);I/R和PAE對(duì)與M1、M3和M5相偶聯(lián)的Gαq/11基因表達(dá)的影響與此相反。

Fig 2 Effects of PAE on M1～M5(A～E)muscarinic receptors gene expression after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

2.4 對(duì)ATP敏感性鉀通道基因表達(dá)的影響 I/R可誘導(dǎo)Kir6.1基因表達(dá)上調(diào)及Kir6.2表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致Kir6.2/Kir6.1比值在腦缺血時(shí)下調(diào)，PAE逆轉(zhuǎn)該病理改變(P ＜0.01，F(xiàn)ig 4)。

Fig 3Effects of PAE on Giα and Gq/11α gene expression after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

3 討論

3.1 調(diào)節(jié)M受體基因表達(dá)，促進(jìn)興奮性突觸傳遞為其抗腦缺血新機(jī)制 根據(jù)M受體i3環(huán)結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和生物效應(yīng)的差異，M受體被分為2類。M1、M3和M5主要通過G蛋白－磷脂酶C-二?；视?三磷酸肌醇(Gq-PLC-DAG/IP3)通路起作用，為M1組;M2和 M4激活 Gi/o-腺苷酸環(huán)化酶(AC)-cAMP信號(hào)通路，為M2組。中樞M1大量表達(dá)于皮層、海馬和紋狀體，通過影響皮層和海馬之間的交互活動(dòng)發(fā)揮調(diào)節(jié)記憶、學(xué)習(xí)等高級(jí)認(rèn)知功能;M2主要分布在海馬、腦干、丘腦等區(qū)域膽堿能神經(jīng)元突觸末梢，調(diào)控中樞乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)釋放;M4主要表達(dá)于紋狀體內(nèi)，與多巴胺(DA)受體共存，抑制紋狀體內(nèi)DA釋放、調(diào)控ACh介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)能力;M5全腦表達(dá)量不足2%，主要在海馬及黑質(zhì)DA能神經(jīng)元表達(dá)［7］，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞M5的激活介導(dǎo)大腦中動(dòng)脈血管舒張反應(yīng)，增加腦血流供應(yīng)，M5基因敲除小鼠喪失腦血管舒張功能，對(duì)腦缺血損傷易感性增高［8］。

有報(bào)道，腦缺血1～3周后，腦血流明顯降低，缺血的皮層M1受體數(shù)目降低，M受體結(jié)合力減弱［9］;雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的腦缺血小鼠，皮層M3、M5受體及膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)的mRNA表達(dá)降低［10］。但有關(guān)M受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與腦缺血的關(guān)系尚無系統(tǒng)報(bào)道。本文基于已有報(bào)道，系統(tǒng)研究了不同M受體亞型及其信號(hào)通路在腦缺血中的改變，并進(jìn)一步探討PAE的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

M1、M3和M5受體調(diào)節(jié)興奮性突觸傳遞，而M2和M4調(diào)節(jié)抑制性突觸傳遞。PAE可上調(diào)腦缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的M1組受體-M1、M3和M5基因表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腦缺血誘導(dǎo)的與M1組受體偶聯(lián)的Gα/11基因表達(dá)的降低，從而促進(jìn)PLC生成，激活 IP3/Ca2+，升高胞內(nèi)Ca2+濃度產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。與此相反，PAE下調(diào)腦缺血誘導(dǎo)的突觸前M2受體基因表達(dá)，抑制其負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)ACh的釋放，產(chǎn)生興奮性突觸效應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;有報(bào)道M4受體位于海馬的興奮性突觸末梢，海馬腦片缺氧再灌注24 h后，CA1區(qū)M4受體的mRNA表達(dá)消失，谷氨酸能突觸傳遞功能降低，與此同時(shí)觀測(cè)到的M受體介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放減弱相一致［11］(海馬腦片再灌注20 h后，氨甲酰膽堿可抑制CA1區(qū)EPSP的生成)，因此，PAE對(duì)M4亞型的調(diào)節(jié)與M2相反，可明顯抑制腦缺血誘導(dǎo)的M4受體基因表達(dá)的降低。

由此可見，PAE對(duì)M受體及其信號(hào)通路調(diào)節(jié)，最終產(chǎn)生共同效應(yīng)，即促進(jìn)興奮性突觸傳遞而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

Fig 4 Effects of PAE on ATP-sensitive potassium(KATP)channel:Kir6.1，Kir6.2 gene expression and Kir6.2/Kir6.1 ratio after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

3.2 增加Kir6.2/Kir6.1比值為其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用新途徑 ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)由內(nèi)向整流 K+通道家族(Kir6.1和 Kir6.2)及硫脲受體異構(gòu)體(SUR1、SUR2A和SUR2B)組成，其開放是缺血預(yù)適應(yīng)重要神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。大量研究表明KATP開放劑可明顯減輕腦缺血后神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死體積，并通過抑制線粒體和死亡受體信號(hào)通路減少神經(jīng)元凋亡，對(duì)腦缺血/再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用［12］。海馬CAl區(qū)對(duì)缺氧極為敏感，缺氧激活K+內(nèi)流使細(xì)胞膜超極化，阻止Na+、Ca2+超載，細(xì)胞膜去極化和胞膜降解，而KATP有助于K+內(nèi)流的激活。Kir6.2基因敲除小鼠在發(fā)生腦缺血15 min后即出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)功能缺失癥狀，梗死體積明顯大于Kir6.2(+/+)野生型小鼠，體外細(xì)胞試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)［13］;心肌缺血60 min/再灌注24 h的犬，心肌線粒體中Kir6.1蛋白表達(dá)水平上調(diào)［14］;離體培養(yǎng)的胎鼠前腦皮層神經(jīng)元，以 Aβ1-42處理24 h后，免疫組化和Western blot研究均證明Kir6.1表達(dá)明顯增加，而KATP開放劑二氮嗪則抑制其蛋白表達(dá)［15］。本研究也證實(shí)腦缺血可誘導(dǎo)Kir6.2基因表達(dá)下調(diào)及Kir6.1基因表達(dá)的上調(diào)，故Kir6.2/Kir6.1比值降低;PAE逆轉(zhuǎn)上述病理改變，增加Kir6.2/Kir6.1比值，激活KATP通道發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。

綜上所述，芍藥苷通過調(diào)節(jié)M受體—G蛋白—KATP通道發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，具有發(fā)展為安全、有效、機(jī)制新穎的抗腦缺血候選藥物應(yīng)用前景。

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