詹冬玲, 韓葳葳, 劉景圣

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118； 2. 吉林大學(xué) 分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130012)

角鯊烯合成酶(SQS)是人體內(nèi)膽固醇合成、 代謝中的一種重要酶, 它能催化兩分子法呢基二磷酸(FPP), 經(jīng)還原性二聚作用, 產(chǎn)生中間體前角鯊烯二磷酸. 在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的還原作用下, 前角鯊烯二磷酸生成角鯊烯, 再經(jīng)進(jìn)一步反應(yīng)生成膽固醇[1-2]. 因此, 抑制SQS的活性, 就能減少角鯊烯的生成量, 從而降低膽固醇水平; 同時(shí)角鯊烯合成酶的催化反應(yīng)在合成類(lèi)異戊二烯的分支途徑后, 所以SQS抑制劑對(duì)類(lèi)異戊二烯的合成沒(méi)有影響. 因此, SQS已成為治療高脂血癥和冠狀動(dòng)脈心臟病的作用靶點(diǎn), 其抑制劑的研究已成為降血脂藥物研制的重要方向[3]. 目前已研發(fā)的SQS小分子抑制劑均存在不同程度的毒副作用, 因此有待于進(jìn)一步的化學(xué)修飾. 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)依據(jù)對(duì)分子理化性質(zhì)如分子極性、 所帶電荷、水溶性和分配系數(shù)等參數(shù)的計(jì)算分析, 可以在計(jì)算機(jī)上方便、 快捷地建造、 分析和修改分子結(jié)構(gòu), 并利用三維技術(shù)實(shí)時(shí)顯示其立體結(jié)構(gòu), 推算出各種低能構(gòu)象, 進(jìn)行構(gòu)象分析并與酶模型相結(jié)合, 對(duì)藥物分子進(jìn)行定量設(shè)計(jì). 根據(jù)軟藥原理對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造, 先獲得候選化合物, 再通過(guò)系統(tǒng)軟件對(duì)分子的理化參數(shù)進(jìn)行分析, 確立篩選依據(jù), 可獲得安全有效的藥物分子.

本文以角鯊烯合成酶(SQS)[4](PDB code 1EZF)的一種抑制劑N-{2-[反-7-氯-1-(2,2-二甲丙基)-5-萘亞甲基-2-氧代-1,2,3,5-四氫苯并1,4-氧雜吖庚因]-乙酰}-天門(mén)冬氨酸(CP-320473)結(jié)構(gòu)作為先導(dǎo)化合物, 使用AutoDock Vina軟件[5]進(jìn)行高通量虛擬篩選, 以尋找高效低毒的新抑制劑化合物.

1 理論方法

先以CP-320473為先導(dǎo)化合物在zinc數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://zinc.docking.org/index.shtml)搜索小分子配體衍生物, 然后用AutoDock Vina軟件[5-6]對(duì)這些化合物進(jìn)行虛擬篩選. 用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接, 利用其grid box把網(wǎng)格的間隔設(shè)為1, 最后得到能量得分最低的小分子. 選取能量最低的化合物(zinc_8442249), 用Gaussian03PM3方法將其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化[7-8].

Affinity[9]是商業(yè)的半柔性分子對(duì)接程序, 在對(duì)接過(guò)程中, 底物與設(shè)定的酶部分殘基可以移動(dòng), 酶的其他部分則固定不動(dòng). 在Monte Carlo構(gòu)象搜尋步驟中, 將默認(rèn)的100步最小化提高到1 000步, 每個(gè)搜尋到的構(gòu)象會(huì)在298 K的恒溫條件下做1 000 ps的分子動(dòng)力學(xué)模擬后再進(jìn)行能量最小化. 在最終得到的10個(gè)最優(yōu)構(gòu)象中, 選取能量最低的構(gòu)象作為進(jìn)一步分子對(duì)接研究的對(duì)象.

本文采用Ludi打分系統(tǒng), 其特點(diǎn)是以蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ), 通過(guò)化合物片段自動(dòng)生長(zhǎng)的方法產(chǎn)生候選藥物的先導(dǎo)化合物. Ludi打分可以評(píng)估受體和配體的結(jié)合強(qiáng)弱.

2 結(jié)果與討論

2.1 高通量虛擬篩選

角鯊烯合成酶具有完全的α螺旋構(gòu)象, 螺旋分3層, 結(jié)構(gòu)如圖1所示. 由圖1可見(jiàn), 整個(gè)蛋白只有一個(gè)結(jié)構(gòu)域, 中間有個(gè)通道凹槽, 而CP-320473位于凹槽中間.

以CP-320473為先導(dǎo)化合物, 采用60%的結(jié)構(gòu)相似度, 通過(guò)建立的篩選策略進(jìn)行篩選, 從zinc數(shù)據(jù)庫(kù)的1 300多萬(wàn)小分子中篩選出100個(gè)小分子, 使用AutoDock Vina軟件對(duì)這100個(gè)小分子分別與角鯊烯合成酶進(jìn)行分子對(duì)接. 最終得到能量得分處于前8位的小分子, 結(jié)果列于表1. 篩選出來(lái)的8種小分子與SQS酶復(fù)合物的對(duì)接如圖2所示; 篩選出來(lái)8種小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)如圖3所示.

表1 配體對(duì)接得分排名Table 1 A ranked score of docked ligands

綜上所述, 選擇能量得分最低的小分子抑制劑zinc_8442249(分子式為C30H30ON2), 對(duì)其進(jìn)一步研究.

2.2 分子對(duì)接

先通過(guò)Binding-Site模塊進(jìn)行抑制劑部位的搜索, 結(jié)合已知的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù), 預(yù)測(cè)SQS抑制劑結(jié)合位點(diǎn)的殘基, 包括Thr50-Phe54和Tyr73; 再用Gaussian03 PM3方法對(duì)CP-320473和新抑制劑zinc_8442249進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化; 最后用Affinity軟件對(duì)接. 表2列出了這兩種抑制劑與酶的相互作用能. 由表2可見(jiàn), CP-320473與酶的相互作用能(-57.53 kJ/mol)比zinc_8442249與酶的相互作用能(-163.65 kJ/mol)高, 表明后者與酶形成的復(fù)合物更穩(wěn)定, 不易脫去, 能更好地?fù)屨伎臻g, 抑制酶的催化反應(yīng)發(fā)生. Ludi的得分(CP-320473: 499; zinc_8442249: 751)也說(shuō)明zinc_8442249是更好的抑制劑.

表2 抑制劑與SQS對(duì)接的總能量、 范德華力、 靜電作用力和Ludi得分Table 2 Total energy(Etotal), van der Waal energy(Evdw) and electrostatic(Eele) between inhibitors and SQS with Ludi score

圖1 CP-320473-SQS復(fù)合物Fig.1 CP-320473-SQS complex

圖2 8種抑制劑-SQS復(fù)合物Fig.2 Eight docked inhibitor-SQS complexes

圖3 8種抑制劑的3D結(jié)構(gòu)Fig.3 3D structure of eight inhibitors

氫鍵對(duì)分子的結(jié)構(gòu)和功能, 尤其是酶與抑制劑的結(jié)合過(guò)程具有重要作用. 圖4為SQS活性位點(diǎn)的部分殘基與zinc_8442249的作用結(jié)果. 由圖4可見(jiàn), zinc_8442249羥基上的氧與K52的咪唑部分形成2個(gè)氫鍵, 因此K52具有穩(wěn)定zinc_8442249的作用. K52殘基位于凹槽的中心部位, 是高度保守的, 因此在SQS中具有穩(wěn)定抑制劑的作用.

圖4 zinc_8442249與SQS間的氫鍵Fig.4 Hydrogen bond between zinc_8442249 and SQS

分子間的非鍵相互作用對(duì)于確定抑制劑與酶之間的相對(duì)位置以及關(guān)鍵殘基非常重要, 由于SQS的口袋較大, 涉及的氨基酸殘基較多, 與zinc_8442249之間的總相互作用能小于-3 kJ/mol的殘基及其相互作用能列于表3. 由表3可見(jiàn), Lys52與SQS形成氫鍵的殘基相互作用能特別是靜電相互作用較大. Pandit等[4]認(rèn)為, SQS的中心凹槽埋于里面, 只有一個(gè)瓣?duì)畹奈膊柯对谕饷? 周?chē)际鞘杷臍埢? 由表3可見(jiàn), Ser51,Ser53,Phe54和SQS殘基的靜電相互作用很大, 計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)相符. Phe73,Arg77,Ile215,Arg218,Ala57,Val58也與抑制劑有較大的靜電相互作用； Tyr179,Leu211,Pro292,Leu183,Phe288與抑制劑的相互作用主要是庫(kù)侖力.

綜上所述, 從氫鍵和相互作用能兩方面看, SQS活性位點(diǎn)的Lys52對(duì)抑制劑zinc_8442249都具有重要作用.

表3 H-89-1與SQS部分位點(diǎn)氨基酸殘基的作用總能量、 范德華力和靜電作用力Table 3 Total energy(Etotal), van der Waal energy(Evdw) and electrostatic (Eele) between H-89-1 and each of individual residues of SQS

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