范東艷，王 蘋，陳玉丙

（1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，西藏 拉薩850000；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，吉林 長春130021；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，吉林 長春130041）

紅景天苷與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對帕金森病大鼠的治療作用

范東艷1，王 蘋2，陳玉丙3

（1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，西藏 拉薩850000；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，吉林 長春130021；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，吉林 長春130041）

目的：研究紅景天苷與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）聯(lián)合應(yīng)用對帕金森?。≒D）大鼠的治療作用，為PD治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：采用貼壁法培養(yǎng)BMSCs，免疫熒光法檢測細(xì)胞表面分子。利用MTT法分析10 mg·L－1紅景天苷對BMSCs增殖分化的影響。將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、紅景天苷治療組、BMSCs治療組、紅景天苷和BMSCs聯(lián)合治療組，每組12只。在相對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)檢測各組大鼠行為學(xué)變化，取各組大鼠腦組織測定酪氨酸羥化酶（TH）m RNA表達(dá)水平。結(jié)果：成功分離提取表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD29和CD44細(xì)胞。紅景天苷作用BMSCs后，BMSCs增殖較對照組更為旺盛且平臺期較對照組延長。PD模型組大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組大鼠行為改變明顯，腦組織內(nèi)TH m RNA表達(dá)水平降低。紅景天苷和BMSCs聯(lián)合治療組大鼠行為學(xué)異常程度較輕，腦組織內(nèi)TH mRNA表達(dá)水平高于其他組（P＜0.05）。結(jié)論：紅景天苷與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用對PD大鼠的治療作用優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用紅景天苷或BMSCs。

紅景天苷；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；帕金森病

紅景天苷是紅景天發(fā)揮作用的主要有效成分，可通過清除自由基、抑制鈣超載和抑制膽堿酯酶活性等作用預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞功能衰退，維持血腦屏障結(jié)構(gòu) 正 常［1－4］。 骨 髓 間 充 質(zhì) 干 細(xì) 胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在一定的條件下可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，并可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過多種途徑修復(fù)組織損傷，且BMSCs在腦內(nèi)能長期存活［5］，因此在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有廣闊前景。雖然紅景天苷與BMSCs均能在一定程度上保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受傷害，但單獨(dú)使用均有一定的局限性，二者聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)發(fā)揮更好的治療作用，達(dá)到單一細(xì)胞或單一藥物無法達(dá)到的效果。有關(guān)紅景天苷和BMSCs聯(lián)合應(yīng)用治療帕金森病（Parkinson’s disease，PD）的研究國內(nèi)外未見報(bào)道。本研究聯(lián)合應(yīng)用紅景天苷和BMSCs治療PD，充分發(fā)揮二者治療的相加作用，旨在為今后藥物與細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：SCXK－（吉）2007－0003。紅景天苷購自中國藥品生物制品檢定所；DMEM／F12、胎牛血清和胰蛋白酶均購自Gibco公司；MTT、碘化丙啶、多聚甲醛、二甲基亞砜、酪氨酸羥化酶（tyrosin hydroxylase，TH）單克隆一抗和阿樸嗎啡（apomorphine）均購自Sigma公司；鼠抗CD29、鼠抗CD44和羊抗鼠FITC均購自Chemicon公司；羊血清購自中杉金橋公司。MK3型酶標(biāo)儀購自Labsystem公司；熒光倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司。

1.2 BMSCs的分離和體外擴(kuò)增 將大鼠脫臼處死；無菌取出雙側(cè)股骨、肱骨，暴露干骺端，用L－DMEM沖洗骨髓置入30 m L離心管；1000 r·min－1離心5 min；輕柔吹打細(xì)胞團(tuán)，以106m L－1細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)基內(nèi)（L－DMEM培養(yǎng)基＋15%胎牛血清＋100 U·m L－1青霉素和100 U·m L－1鏈霉素）；細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)。72 h后更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞長到80%融合時(shí)用0.25%的胰酶消化傳代，擴(kuò)增。采用及時(shí)、反復(fù)傳代法對細(xì)胞進(jìn)行純化。

1.3 BMSCs表型鑒定 將第3代的BMSCs種植于多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS洗3次，每次5 min；加入5%封閉血清－0.3%Trito 100－PBS，37℃封閉30 min；加一抗：鼠抗CD29（1∶50）、CD44（1∶50）。陰性對照加入PBS，置濕盒內(nèi)，4℃過夜；PBS洗3次，每次5 min；加入FITC羊抗鼠IgG（1∶100）37℃孵育l h；PBS洗3次，每次5 min；PI復(fù)染細(xì)胞核，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。熒光標(biāo)記細(xì)胞核為紅色，細(xì)胞漿表達(dá)產(chǎn)物為綠色。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 體外實(shí)驗(yàn)部分分為2組，實(shí)驗(yàn)組加入10 mg·L－1紅景天苷［6］作用BMSCs，對照組不給藥；取第3代BMSCs調(diào)整密度為1×105m L－1，分別接種于96孔板內(nèi)；每板2組（實(shí)驗(yàn)組和對照組），一共接種7塊板，每天取1塊板采用MTT法檢測細(xì)胞增殖。MTT法：細(xì)胞貼壁1 d后，棄培養(yǎng)基，每孔加入20μL MTT，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，之后加入二甲基亞砜，每孔200μL，用酶標(biāo)儀在590 nm波長下測定各孔A值。細(xì)胞增殖抑制率＝［1－（實(shí)驗(yàn)孔A值－空白孔A值）／（對照孔A值－空白孔A值）］×100%。分別于1～7 d相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測。

1.5 模型動(dòng)物制備及行為學(xué)檢測 Wistar大鼠術(shù)前進(jìn)行行為學(xué)測試，確定無異常旋轉(zhuǎn)行為。用10%水合氯醛（3 m L·kg－1）腹腔注射，睫毛反射消失后，將大鼠腹臥位固定于立體定位儀上，參照Paxinos and Watson的 《The Rat Brain Atlas》圖譜，常規(guī)去毛消毒，選擇紋狀體部，坐標(biāo)為：前囟前1.0 mm，中線右旁開2.5 mm，硬膜下4.6 mm。用微量注射器將LPS 5μL［7］緩慢注射至右側(cè)紋狀體，給藥速度為1μL·min－1，對照組紋狀體注射5μL PBS。手術(shù)毀損后第2周開始進(jìn)行阿樸嗎啡（0.5 mg·kg－1）誘導(dǎo)的行為學(xué)檢測。大鼠置于旋轉(zhuǎn)行為測試儀內(nèi)，記錄大鼠30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。每分鐘向健側(cè)（左側(cè)）旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均＞7圈大鼠為成功的PD模型大鼠。

1.6 動(dòng)物分組及給藥 在體實(shí)驗(yàn)部分將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、紅景天苷治療組、BMSCs治療組、紅景天苷和BMSCs聯(lián)合治療組，每組12只。均在造模后2周開始給藥，假手術(shù)組不給藥；模型組每日經(jīng)尾靜脈給予5 mg·kg－1生理鹽水1次；紅景天苷治療組每日經(jīng)尾靜脈給藥1次（5 mg·kg－1）［8］，連續(xù)給予15 d；BMSCs治療組以1×106m L－1BMSCs移植紋狀體內(nèi)，注射體積為10μL，留針10 min，緩慢退針，常規(guī)消毒并縫合傷口，每隔7 d移植1次，共移植2次。紅景天苷和BMSCs聯(lián)合治療組大鼠給予紅景天苷治療組和BMSCs治療組聯(lián)合的給藥方式。

1.7 RT－PCR 檢測 TH 根據(jù)文獻(xiàn)［9－10］合成引物序列。TH引物序列：上游，5′－GGACGGCGACAGAGTCTCAT－3′；下游，5′－AGCTTCCGACGCTGGCGATA－3′（512 bp）；β－actin：上游，5′－TGTCCCTGTATGCCTCTGGT－3′； 下 游， 5′－TTGATGTCACGCACGATTTC－3′（217 bp）。大鼠麻醉后，斷頭取腦，分離中腦腹側(cè)包括黑質(zhì)區(qū)和腹側(cè)被蓋區(qū)，取約100 mg腦組織，剪碎，提取總RNA，以1%的瓊脂糖凝膠電泳，確定mRNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1 h，75℃、10 min滅活禽類成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）。使用晶芯熒光定量PCR系列通用試劑盒及晶芯RT－Cycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以β－actin作為內(nèi)參照，采用2－Δ（ΔCt）法計(jì)算產(chǎn)物相對量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)以±s表示，兩樣本均數(shù)組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)變化 原代培養(yǎng)BMSCs接種72 h后細(xì)胞開始貼壁生長，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞有偽足伸出，呈集落式生長，7 d左右可見細(xì)胞有80%～90% 融合，行傳代處理。取第3代BMSCs檢測細(xì)胞表面抗原，本研究分離提取的BMSCs為表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD29和CD44的細(xì)胞。見圖1（插頁一）。

2.2 紅景天苷作用不同時(shí)間BMSCs數(shù)量 當(dāng)紅景天苷作用BMSCs后，BMSCs增殖較對照組更為旺盛且平臺期較對照組延長。見圖2。

圖2 紅景天苷作用不同時(shí)間BMSCs數(shù)量Fig.2 Number of BMSCs after treated with salidroside for different time

2.3 各組大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù) 旋轉(zhuǎn)行為是檢測模型動(dòng)物行為學(xué)異常的代表性實(shí)驗(yàn)，旋轉(zhuǎn)次數(shù)多寡表示病情的輕重。BMSCs治療組、紅景天苷治療組、紅景天苷和BMSCs聯(lián)合治療組模型大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)隨時(shí)間增加有不同程度減少，以上3組與模型組比較，旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與BMSCs治療組和紅景天苷治療組大鼠比較，紅景天苷和BMSCs聯(lián)合治療組大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 紅景天苷作用不同時(shí)間各組大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)Tab.1 Rotation number of rats in various groups after treated with salidroside for different time（n＝10±s）

表1 紅景天苷作用不同時(shí)間各組大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)Tab.1 Rotation number of rats in various groups after treated with salidroside for different time（n＝10±s）

＊P＜0.05 vs PD model group；△P＜0.05 vs BMSCs group；＃P＜0.05 vs salidroside group.

Group Rotation number Before treatment 2 weeks after treatment 4 weeks after treatment 6 weeks after treatment Sham operation 0 0 0 0 PD model 16.70±4.65 17.73±2.43 17.63±1.96 17.25±3.21 BMSCs treatment 16.36±3.15 11.53±2.01＊ 10.22±2.34＊ 7.17±2.57＊Salidroside treatment 16.13±2.42 13.11±2.37＊ 12.72±2.14＊ 9.48±2.85＊Salidroside＋BMSCs treatment 16.11±3.22 9.53±1.23＊△＃ 6.19±2.38＊△＃ 4.98±2.17＊△＃

2.4 各組大鼠TH mRNA表達(dá)水平 各組大鼠在造模后第6周收集組織提取總RNA，采用即時(shí)RT－PCR方法檢測腦組織內(nèi)TH m RNA表達(dá)水平，各組大鼠TH mRNA水平各有不同，紅景天苷聯(lián)合BMSCs治療組大鼠TH m RNA的轉(zhuǎn)錄水平較高，基因變化倍數(shù)為2.2。單純BMSCs治療組基因變化倍數(shù)相對PD組為1.8倍，單純紅景天苷組基因變化倍數(shù)相對PD組為1.5倍。

3 討 論

BMSCs是存在于骨髓間質(zhì)中具有多向分化潛能、類似于胚胎干細(xì)胞的一種多能干細(xì)胞［11］。大量研究［12－13］顯示：BMSCs移植對多系統(tǒng)疾病均有療效，同時(shí)也是組織工程研究理想的種子細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中采用貼壁法分離、提取BMSCs，培養(yǎng)3 d后鏡下可見細(xì)胞貼壁，呈梭形、單核、折光率好且形成集落。傳代后細(xì)胞生長活躍，利用反復(fù)傳代法對細(xì)胞進(jìn)行純化。傳至第3代檢測BMSCs表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示CD29和CD44均有較高的表達(dá)率。

在本研究中，取第3代細(xì)胞與10 mg·L－1紅景天苷共培養(yǎng)，對照組不加紅景天苷。通過生長曲線的繪制探討紅景天苷對BMSCs增殖、分化的影響。體外實(shí)驗(yàn)生長曲線顯示：在潛伏期由于細(xì)胞對傳代操作所致?lián)p傷的恢復(fù)及新環(huán)境的適應(yīng)2組細(xì)胞未見差別；進(jìn)入對數(shù)生長期后，紅景天苷作用BMSCs組細(xì)胞增殖明顯活躍；進(jìn)入平臺期后，對照組細(xì)胞衰退較實(shí)驗(yàn)組快，提示紅景天苷對BMSCs增殖、分化有促進(jìn)作用，且能延緩細(xì)胞衰老。

本研究在體實(shí)驗(yàn)中紅景天苷與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用治療PD結(jié)果顯示：紅景天苷和BMSCs聯(lián)合治療組大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)較PD模型組明顯減少，較BMSCs移植治療組和紅景天苷治療組大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)亦有不同程度減少，提示紅景天苷與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用治療PD較單獨(dú)使用效果更理想，二者起到了優(yōu)勢互補(bǔ)的作用。

TH是多巴胺合成的限速酶，在多巴胺合成的過程中起關(guān)鍵作用，并且TH也是腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的蛋白標(biāo)志物。動(dòng)物腦內(nèi)TH的含量不足可導(dǎo)致PD的一系列臨床癥狀。本研究中RT－PCR檢測結(jié)果顯示：各組大鼠TH mRNA轉(zhuǎn)錄水平各有不同，紅景天苷聯(lián)合BMSCs作用PD模型大鼠后，腦內(nèi)TH mRNA的轉(zhuǎn)錄水平高于PD組；單純應(yīng)用BMSCs組和單純應(yīng)用紅景天苷組腦內(nèi)TH mRNA的轉(zhuǎn)錄水平也較PD組有不同程度的增加，但是低于聯(lián)合應(yīng)用組腦內(nèi)TH mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

綜上所述，本研究成功分離、提取了BMSCs，通過反復(fù)傳代方法對細(xì)胞進(jìn)行純化。采用紅景天苷與BMSCs共培養(yǎng)，紅景天苷可促進(jìn)BMSCs增殖、分化、延續(xù)細(xì)胞衰老，同時(shí)又不影響B(tài)MSCs生物學(xué)特性；將紅景天苷與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用治療PD模型大鼠在TH基因轉(zhuǎn)錄水平和行為學(xué)異常改善方面均優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用。

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Treatment effect of salidroside combined with bone marrow mesenchymal stem cells on rats with Parkinson’s disease

FAN Dong－yan1，WANG Ping2，CHEN Yu－bing3
（1.Department of Preventive Medicine，Medical School，Tibet University，Lhasa 850000，China；2.Department of Otorhinolaryngology and Head－Neck Surgery，F(xiàn)irst Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；3.Depatment of Nuclear Medicine，Second Hospital，J ilin University，Changchun 130041，China）

Objective To study the treatment effect of salidroside combined with bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）on rats with Parkinson’s disease（PD），and to provide experiment basis for curring Parkinson’s disease.Methods The BMSCs were cultured adherently，the cell surface molecules were detected by immunofluorescence.The effect of 10 mg·L－1salidroside on the proliferation and differentiation of BMSCs was detected by MTT.60 Wistar rats were randomly divided into sham group，model group，salidroside treatment group，BMSCs treatment group，and salidroside and BMSCs combination therapy group.The behavior changes were detected at a specific time and the levels of tyrosin hydroxylase（TH）mRNA in brain tissue were detected.Results The setm cell markers CD29 and CD44 were expressed successfully.Compared with control group，the proliferation of BMSCs got bigger and the plateau got longer after treated with salidroside.The rotation number of PD model rats was the least compared with the other groups（P＜0.05）.The expression level of TH mRNA was decreased.The behavior abnormalities of PD model rats were improved and the level of TH mRNA was increased after treated with salidroside and BMSCs compared with the other groups（P＜0.05）.Conclusion The treatment efficacy of salidroside combined with BMSCs on PD rats is better than salidroside or BMSCs alone.

salidroside；bone mesenchymal stem cells；Parkinson’s disease

R745

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1073－04

2012－05－23

國家自然科學(xué)基金資助課題（81160360）；西藏大學(xué)科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助課題（2010－2013）

范東艷（1973－），女，吉林省吉林市人，講師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事干細(xì)胞應(yīng)用研究。

陳玉丙（Tel：0431－88796179，E－mail：yb0707＠163.com）