人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)*

朱登納1)，王 軍1)#，賈延劼2)，牛國輝1)，張博愛2)，吳值榮1)
1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院河南省小兒腦癱康復(fù)治療中心鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州450052 #通訊作者，女，1963年7月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:小兒神經(jīng)康復(fù)，E-mail:wj3028@163.com

人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1;基因轉(zhuǎn)染;人臍帶血;神經(jīng)干細(xì)胞

目的:構(gòu)建人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)真核表達(dá)載體，并在人臍血神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)中表達(dá)。方法:采用RT-PCR法從人胎肝中克隆IGF-1基因，將其導(dǎo)入真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍血NSCs。分別采用RT-PCR和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因NSCs中IGF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果:瓊脂糖電泳顯示RT-PCR擴(kuò)增出462 bp的條帶;重組載體pcDNA3.1-IGF-1經(jīng)HindⅢ與BamHⅠ雙酶切后，得到5 428 bp和462 bp的兩個(gè)條帶;目的基因轉(zhuǎn)染的NSCs經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出一條與目的基因一致的條帶;免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)到IGF-1蛋白的表達(dá)。結(jié)論:成功構(gòu)建了人IGF-1基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染后IGF-1重組蛋白在人臍血NSCs中能成功表達(dá)。

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是指一類能夠自我更新并具有多向分化潛能(神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞)的未分化細(xì)胞群［1］。這種活躍的增殖狀態(tài)及多向分化潛能使得NSCs可作為修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的理想材料［2］。胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-likegrowth factor-1，IGF-1)在神經(jīng)系統(tǒng)正常生長(zhǎng)發(fā)育和成熟的全過程中發(fā)揮著重要作用［3］，同時(shí)體內(nèi)外多種創(chuàng)傷模型也顯示了其重要的神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)保護(hù)作用［4］。既往研究［5-8］顯示，單獨(dú)進(jìn)行NSCs移植或單獨(dú)應(yīng)用IGF-1均對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷動(dòng)物模型起到了良好的治療作用，促進(jìn)了神經(jīng)功能的恢復(fù)。而將二者結(jié)合，選擇IGF-1對(duì)NSCs進(jìn)行基因修飾構(gòu)造基因工程N(yùn)SCs，將可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療發(fā)揮更大的作用。為此作者構(gòu)建了含有人IGF-1基因的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-IGF-1)載體，并通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染臍血NSCs，建立基因修飾NSCs(NSCs-IGF-1)，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Trizol、LipofectamineTM2000(美國 Invitrogen公司);瓊脂糖粉(北京Solarbio公司);RTPCR試劑盒、DMEM/F12培養(yǎng)基、DH5α(Gibco公司);BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶、IGF-1抗體(Promega公司);免疫熒光試劑盒(FITC)、cDNA第一鏈的合成試劑盒、DNA Marker 15000(TaKaRa公司);膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(美國OMEGA公司);DNA Marker D2000(北京天根生化科技有限公司);免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);質(zhì)粒pcDNA3.1、pcDNA3.1-GFP、P3代臍血源性NSCs(河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院神經(jīng)免疫實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1的構(gòu)建 用Trizol試劑從人新鮮胎肝組織塊(胎肝來自鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院4～5個(gè)月引產(chǎn)的胎兒肝臟，經(jīng)產(chǎn)婦及家屬同意用于科學(xué)研究，簽署知情同意書，并經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意)中抽提總RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank公布的序列(NM_000618)，設(shè)計(jì)IGF-1(462 bp)引物為:上游引物5’-GACGGATCCATGGGAAAAATCAGCAGTCT TCCA-3’，下游引物5’-GACAAGCTTCTACATCCTG TAGTTCTTGTTTCC-3’。PCR反應(yīng)體系:模板cDNA 2 μL，10 pmol/L上、下游引物各2 μL，2 mmol/L dNTP 4 μL，10×PCR buffer 5 μL，Taq酶1 μL，加入適量的雙蒸水，使總體積達(dá)50 μL。PCR反應(yīng)條件: 98℃預(yù)變性5 min;98℃變性10 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);最后72℃ 延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，凝膠成像儀拍照。切取目的基因片段進(jìn)行純化回收，并將酶切片段按照目的基因片段∶質(zhì)粒載體(pcDNA3.1)為10∶1的比例用T4DNA連接酶16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，接種到氨芐青霉素抗性的LB平板培養(yǎng)過夜，次日挑取單個(gè)菌落接種到含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中搖菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，用BamHⅠ與HindⅢ雙酶切鑒定質(zhì)粒。對(duì)酶切正確的質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序，并與公布的人IGF-1基因序列進(jìn)行比對(duì)。大量提取質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染臍血NSCs 按照文獻(xiàn)［9］的方法分離培養(yǎng)臍血NSCs，將傳至第3代的細(xì)胞以2× 105/孔接種于6孔培養(yǎng)板，孔內(nèi)預(yù)先加有經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片，加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基37℃ 體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將1 μg質(zhì)粒DNA與2 μL脂質(zhì)體分別用100 μL無血清無抗生素的DMEM/F12稀釋，混合后室溫放置30 min。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清無抗生素培養(yǎng)基DMEM/F12洗細(xì)胞2次，然后將上述質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合物緩慢均勻加到細(xì)胞表面。37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行檢測(cè)。以攜帶綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP對(duì)臍血NSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，檢測(cè)轉(zhuǎn)染率，隨后分為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1 (對(duì)照組)及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1(實(shí)驗(yàn)組)分別對(duì)NSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以胎肝組織總RNA的PCR產(chǎn)物為陽性對(duì)照組。

1.4 轉(zhuǎn)IGF-1基因的NSCs檢測(cè)

1.4.1 IGF-1 mRNA表達(dá)的檢測(cè) 取基因轉(zhuǎn)染后48 h的NSCs采用Trizol試劑分別提取實(shí)驗(yàn)組和空質(zhì)粒對(duì)照組總RNA，分光光度計(jì)測(cè)總RNA的純度。cDNA第一鏈的合成和PCR過程分別采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，按照說明書操作。

1.4.2 IGF-1蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫熒光化學(xué)染色法。轉(zhuǎn)染后3 d用40 g/L多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，隨后用體積分?jǐn)?shù)3%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，傾去血清，勿洗，在標(biāo)本上滴加1∶100稀釋的小鼠抗人IGF-1抗體，4℃濕盒過夜，pH 7.4 PBS沖洗，每次5 min，共3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1 h，水溶性封片劑封片后直接在熒光顯微鏡下觀察拍照。觀察時(shí)選用藍(lán)色激發(fā)光，陽性部位顯示綠色熒光。陰性對(duì)照組使用PBS代替一抗。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1基因的克隆 胎肝組織總RNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在462 bp處出現(xiàn)目的條帶，條帶清晰且無雜帶(圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1的鑒定 重組體pcDNA3.1-IGF-1經(jīng)HindⅢ與BamHⅠ雙酶切后，電泳結(jié)果示在5 428 bp處和462 bp處各有一條亮帶，與質(zhì)粒載體及目的基因大小相符，證明所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1大小及方向正確?？召|(zhì)粒組只在5 428 bp處有一條亮帶(圖2)。對(duì)酶切正確的質(zhì)粒行測(cè)序鑒定，結(jié)果示目的基因與Gen-Bank IGF-1序列相符。

2.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的NSCs的轉(zhuǎn)染率 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白的表達(dá)情況(圖3)，經(jīng)計(jì)算得出脂質(zhì)體介導(dǎo)的NSCs的轉(zhuǎn)染率為35.5%。

2.4 IGF-1基因在基因轉(zhuǎn)染NSCs中的表達(dá) 經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示:實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增出一條約462 bp條帶，與陽性對(duì)照組條帶相平齊，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組無目的條帶的出現(xiàn)(圖4)。

2.5 IGF-1蛋白在轉(zhuǎn)基因IGF-1 NSCs中的表達(dá)轉(zhuǎn)染目的基因的NSCs行IGF-1免疫熒光化學(xué)染色，呈抗IGF-1陽性(圖5)。

3 討論

NSCs是基因治療神經(jīng)功能損傷的理想種子細(xì)胞，以NSCs作為載體將外源基因移植到受損的神經(jīng)系統(tǒng)具有其他載體細(xì)胞不可比擬的優(yōu)勢(shì):第一，攜帶基因的NSCs能夠與宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行整合，通過與宿主神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系發(fā)揮其功能;第二，可提供所攜帶的靶基因表達(dá)的產(chǎn)物，進(jìn)而達(dá)到基因治療的目的。

該實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞工程與基因治療相結(jié)合，把IGF-1基因成功轉(zhuǎn)染到載體細(xì)胞NSCs中，使IGF-1基因作為內(nèi)源性的基因，由NSCs自身調(diào)控其合成、分泌。這樣既可避免局部用IGF-1治療時(shí)，由于有效成分被降解、稀釋及生理性屏障的作用，無法達(dá)到持續(xù)高效的濃度，又可避免在局部一次性大量注射藥物造成潛在的毒性，而通過細(xì)胞的調(diào)控作用可使組織達(dá)到安全有效的劑量。

該實(shí)驗(yàn)中將重組體轉(zhuǎn)染NSCs，以建立基因修飾NSCs-IGF-1。目前常用的轉(zhuǎn)染方法有電穿孔法、顯微注射法、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、病毒轉(zhuǎn)染法及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等［10］。其中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法中所包含的磷脂是細(xì)胞生物膜的基本骨架，在目的基因?qū)爰?xì)胞后，脂質(zhì)體又可在胞質(zhì)內(nèi)被降解，因此該方法具有低毒、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又由于無基因插入片段大小的限制，轉(zhuǎn)染率高，從而成為目前基因轉(zhuǎn)染最常用的方法之一［11］。該研究以新型陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000為載體，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染率達(dá)35.5%。轉(zhuǎn)染NSCs經(jīng)RT-PCR和免疫熒光化學(xué)染色示轉(zhuǎn)染后NSCs中可檢測(cè)到IGF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，證明基因轉(zhuǎn)染獲得成功。

［1］ Gage FH.Mammalian neural stem cells［J］.Science，2000，287(5457):1433

［2］Okano H.Neural stem cells and strategies for the regeneration of the central nervous system［J］.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2010，86(4):438

［3］Ye P，D’Ercole AJ.Insulin-like growth factor actions during development of neural stem cells and progenitors in the central nervous system［J］.J Neurosci Res，2006，83(1):1

［4］ Guan J.Insulin-like growth factor-1 and its derivatives: potential pharmaceutical application for ischemic brain injury［J］.Recent Pat CNS Drug Discov，2008，3(2):112

［5］Guzman R，Bliss T，De Los Angeles A，et al.Neural progenitor cells transplanted into the uninjured brain undergo targeted migration after stroke onset［J］.J Neurosci Res， 2008，86(4):873

［6］Bühnemann C，Scholz A，Bernreuther C，et al.Neuronal differentiation of transplanted embryonic stem cell-derived precursors in stroke lesions of adult rats［J］.Brain，2006，129(Pt 12):3238

［7］Guan J，Miller OT，Waugh KM，et al.Insulin-like growth factor-1 improves somatosensory function and reduces the extent of cortical infarction and ongoing neuronal loss after hypoxiaischemia in rats［J］.Neuroscience，2001，105(2):299

［8］Saatman KE，Contreras PC，Smith DH，et al.Insulin-like growth factor-1(IGF-1)improves both neurological motor and cognitive outcome following experimental brain injury［J］.Exp Neurol，1997，147(2):418

［9］朱登納，張博愛，王軍，等.臍血源性神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的治療作用研究［J］.江蘇醫(yī)藥，2010，36(24):2932

［10］Duan Y，Zhang S，Wang B，et al.The biological routes of gene delivery mediated by lipid-based non-viral vectors［J］.Expert Opin Drug Deliv，2009，6(12):1351

［11］Montier T，Benvegnu T，Jaffrès PA，et al.Progress in cationic lipid-mediated gene transfection:a series of bio-inspired lipids as an example［J］.Curr Gene Ther，2008，8(5):296

Construction of eukaryotic expression vector carrying human insulin-like growth factor-1 gene and expression in human neural stem cells

ZHU Dengna1)，WANG Jun1)，JIA Yanjie2)，NIU Guohui1)，ZHANG Bo’ai2)，WU Zhirong1)1)Rehabilitation and Treatment Center for Child Cerebral Palsy，the Third Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052 2)Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

human insulin-like growth factor-1;gene transfection;human umbilical cord blood;neural stem cell

Aim:To construct eukaryotic expression vector for human insulin like growth factor-1(IGF-1)，and observe its expression in human umbilical cord blood(HUCB)neural stem cells(NSCs).Methods:IGF-1 was cloned from human fetal liver by RT-PCR and then inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1.The recombinant plasmid pcDNA3.1-IGF-1 was transfected into HUCB NSCs with liposome-mediated method.IGF-1 mRNA and protein expressions in HUCB NSCs were detected by RT-PCR and immunocytochemistry，respectively.Results:A fragment of 462 bp was obtained by agarose electrophoresis after RT-PCR，and two fragments(5 428 bp and 462 bp)were obtained from the recombined plasmid after enzyme digestion.After transfection，a fragment that was consistent with the target gene was obtained，and the results of immunocytochemistry proved that there was expression of the transfected IGF-1 in HUCB NSCs.Conclusion:Eukaryotic expression vector containing IGF-1 has been successfully constructed.IGF-1 protein could be expressed in HUCB NSCs successfully.

R329.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.02.006

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目 200703066

(2011-07-13收稿 責(zé)任編輯徐春燕)