郭素平，馬 軍，唐芙愛，魯 迪，段芳齡，郭 琦

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化研究所鄭州 450014

#通訊作者，男，1966年8月生，博士，副教授，研究方向:消化道腫瘤的防治、腫瘤細(xì)胞免疫治療，E-mail:madejun_2@yahoo.com.cn

食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Galectin-9和MMP-2蛋白的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

郭素平1)，馬 軍2)#，唐芙愛1)，魯 迪1)，段芳齡2)，郭 琦1)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化研究所鄭州 450014

#通訊作者，男，1966年8月生，博士，副教授，研究方向:消化道腫瘤的防治、腫瘤細(xì)胞免疫治療，E-mail:madejun_2@yahoo.com.cn

食管腫瘤;鱗狀細(xì)胞癌;組織芯片;半乳糖凝集素-9;基質(zhì)金屬蛋白酶-2;預(yù)后

目的:探討食管鱗狀細(xì)胞癌(簡稱食管鱗癌)組織中Galectin-9和MMP-2蛋白的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。方法:制備組織芯片，應(yīng)用免疫組化SP法檢測63例食管鱗癌及其癌旁正常食管黏膜組織中Galectin-9和MMP-2蛋白的表達(dá)，分析2種蛋白的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:食管鱗癌組織中Galectin-9蛋白的陽性表達(dá)率為62.5%，低于癌旁正常食管黏膜組織的89.3%(χ2=11.529，P＜0.001)，其表達(dá)與腫瘤的分化程度有關(guān)(P= 0.001)，且陽性表達(dá)者生存期更長(P=0.013)。食管鱗癌組織中MMP-2蛋白的陽性表達(dá)率為67.9%，高于癌旁正常食管黏膜組織的35.7%(χ2=9.633，P=0.001)，其表達(dá)與腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)，且陽性表達(dá)者生存期較短(P=0.036)。結(jié)論:食管鱗癌組織中Galectin-9低表達(dá)，MMP-2高表達(dá);檢測二者可用于判斷食管鱗癌預(yù)后。

半乳糖凝集素(Galectins)家族成員參與了許多病理和生理過程，包括細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附、RNA轉(zhuǎn)錄后加工、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞凋亡等［1］。目前，Galectin-1、3的研究較為深入［2］，Galectin家族其他成員的研究報道較少。Dardalhon等［3］的研究顯示Tim-3/Galectin-9通路在激活髓系來源的抑制細(xì)胞方面起著一定作用，能使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和攻擊，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移中面臨的第一道屏障，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的酶類，主要催化水解細(xì)胞外基質(zhì)，和腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［4-6］。研究［7］顯示 MMPs可能參與了 Galectin-9的表達(dá)調(diào)節(jié)。作者應(yīng)用免疫組化方法探討食管鱗狀細(xì)胞癌(簡稱食管鱗癌)組織中Galectin-9、MMP-2蛋白的表達(dá)以及二者與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 63例標(biāo)本來自河南省腫瘤醫(yī)院胸外科2005年11月至2008年2月收治的食管鱗癌手術(shù)患者，所有標(biāo)本均包括癌組織及其癌旁正常組織(距切緣＞5 cm)?；颊咝g(shù)前均未行放化療或免疫治療。影像學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移。63例中男40例，女23例;年齡38～76歲;術(shù)后按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ+Ⅱa期36例，Ⅱb+Ⅲ期27例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例。所有患者接受了食管癌切除、胃食管吻合術(shù)和淋巴結(jié)清掃，術(shù)后分別于2007、2009、2011年進(jìn)行了3次隨訪，共隨訪了30位患者，隨訪結(jié)束時，死亡17例;死亡的患者中有16例發(fā)生血性轉(zhuǎn)移，其中肺轉(zhuǎn)移4例，肝轉(zhuǎn)移8例，腦轉(zhuǎn)移1例，骨骼和脊柱轉(zhuǎn)移3例，另有1例死于冠心病。

1.2 組織芯片制備 制作帶有陣列孔的受體蠟塊，根據(jù)HE切片在供體組織蠟塊上選取典型的區(qū)域，用采樣針采樣放入受體蠟塊陣列孔中，每個組織芯片的直徑為1 mm。

1.3 Galectin-9和MMP-2蛋白的免疫組化染色組織芯片常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸抗原修復(fù)。Galectin-9兔抗人多克隆抗體、MMP-2兔抗人抗體(Bioworld公司)按1∶200稀釋。采用免疫組化SP二步法(二抗和DAB顯色劑均購自Dako公司)，操作按照PV-9000試劑盒說明進(jìn)行，DAB顯色。以PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷:Galectin-9和MMP-2以胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)黃染為陽性。高倍鏡下每張切片至少觀察5個視野，共計數(shù)300～500個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分率;染色強弱的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:無著色0分，淡黃色1分，黃色或深黃色2分，褐色或深褐色3分。參照文獻(xiàn)［8］計算積分，積分＞80為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用配對χ2檢驗比較食管鱗癌組織與癌旁正常組織Galectin-9和MMP-2表達(dá)的差異，采用χ2檢驗分析2種蛋白與食管鱗癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，Galectin-9和MMP-2表達(dá)的關(guān)聯(lián)性用配對資料的關(guān)聯(lián)性分析。生存曲線的繪制用Kaplan-Meier方法，對生存期的檢驗用log-rank檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌和癌旁正常組織中 Galectin-9和MMP-2蛋白的表達(dá) 見圖1、2，表1、2。除去染色過程中的脫片組織標(biāo)本，可用癌組織標(biāo)本63例，正常組織標(biāo)本56例，癌和癌旁配對組織56例。

圖1 組織芯片HE染色大體圖(A)和免疫組化大體圖(B)

圖22 種組織中Galectin-9(A)及MMP-2(B)免疫組織化學(xué)染色

表1 食管鱗癌和癌旁正常組織中Galectin-9蛋白的表達(dá) 例(%)

表2 食管鱗癌和癌旁正常組織中MMP-2蛋白的表達(dá) 例(%)

2.2 食管鱗癌組織中Galectin-9和MMP-2蛋白的表達(dá)與患者人口學(xué)資料及病理指標(biāo)的關(guān)系 見表3。蛋白陽性表達(dá)者的中位生存期為55個月，高于陰性表達(dá)者的28個月(χ2=6.162，P=0.013);MMP-2蛋白陽性表達(dá)者的中位生存期為25個月，低于陰性表達(dá)者的52個月(χ2=4.406，P=0.036)。見圖3。

表3 食管鱗癌組織中Galectin-9和MMP-2蛋白的表達(dá)與患者人口學(xué)資料及病理指標(biāo)的關(guān)系例(%)

表4 食管鱗癌組織中Galectin-9和MMP-2表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 例

2.3 食管鱗癌組織中Galectin-9和MMP-2蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 結(jié)果見表4。

2.4 食管鱗癌組織中Galectin-9和MMP-2蛋白的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 食管鱗癌組織中Galectin-9

3 討論

Galectin-9屬于內(nèi)源性凝集素家族，在介導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡、黏附、細(xì)胞間聚集、炎癥反應(yīng)的調(diào)控、調(diào)節(jié)免疫和腫瘤轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了重要作用［9］。

既往研究表明，在多種腫瘤中缺少Galectin-9表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，從而影響預(yù)后。在黑色素痣組織中Galectin-9高表達(dá)，而在黑色素瘤組織中Galectin-9低表達(dá)，尤其在轉(zhuǎn)移性的黑色素瘤組織中低表達(dá)更明顯，在厚度＞1.5 mm的黑色素瘤組織中，Galectin-9表達(dá)陽性患者生存率是95.2%，陰性患者生存率是57.2%［10］;在乳癌組織中有類似結(jié)果，伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的Galectin-9陽性患者無瘤生存率為95%，而Galectin-9陰性患者的無瘤生存率為44%，即使在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，Galectin-9陽性患者的無瘤生存率也達(dá)到90%，而Galectin-9陰性患者的無瘤生存率僅為25%［11］。該研究中，Galectin-9蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織，且食管鱗癌高分化者Galectin-9表達(dá)較高，提示Galectin-9可能抑制食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展;隨訪結(jié)果顯示，Galectin-9蛋白陽性患者的中位生存期高于Galectin-9蛋白陰性患者，提示Galectin-9蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，與上述報道一致。

MMP-2作為降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，對惡性腫瘤的發(fā)展及間質(zhì)血管生成起著重要作用。該研究表明，食管鱗癌組織中MMP-2高表達(dá)，這與其他研究［12-13］結(jié)果一致。此外，MMP-2與食管鱗癌的臨床病理特征密切相關(guān)，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的食管鱗癌患者M(jìn)MP-2陽性率明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率，TNM分期高者食管鱗癌組織中MMP-2的陽性表達(dá)率也較高，且MMP-2能夠促進(jìn)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移，此外，生存分析顯示MMP-2陰性組的中位生存期高于MMP-2陽性組，說明MMP-2蛋白的表達(dá)升高可致預(yù)后不良。

Chabot等［7］研究顯示MMPs參與了Jurkat細(xì)胞釋放 Galectin-9的過程。該實驗食管鱗癌組織中MMP-2和Galectin-9蛋白的表達(dá)無關(guān)聯(lián)性，可能為兩因子在Jurkat細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)不一致所致，但兩因子對患者預(yù)后都有影響。

綜上所述，食管鱗癌組織中Galectin-9低表達(dá)，MMP-2高表達(dá);檢測二者可用于判斷食管鱗癌預(yù)后。

［1］Elola MT，Wolfenstein-Todel C，Troncoso MF，et al.Galectins:matricellular glycan-binding proteins linking cell adhesion，migration，and survival［J］.Cell Mol Life Sci，2007， 64(13):1679

［2］龐霞，鄭湘予，李晟磊.食管鱗癌組織中半乳糖凝集素-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，45(1):8

［3］Dardalhon V，Anderson AC，Karman J，et al.Tim-3/galectin-9 pathway:regulation of Th1 immunity through promotion of CD11b+Ly-6G+myeloid cells［J］.J Immunol，2009，185(3):1383

［4］呂曉智，鄒亞光，殷學(xué)民，等.MMP1 mRNA在口腔鱗癌與正常黏膜的表達(dá)及臨床意義［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，28(8):1362

［5］溫洪濤，張蕾，張繼昌，等.人食管鱗癌組織中MMP-2、MMP-9和TIMP-1、TIMP-2的表達(dá)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2006，41(3):418

［6］陳香麗，王連才，張王剛，等.S100A4和MMP9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，28(7):1254

［7］Chabot S，Kashio Y，Seki M，et al.Regulation of galectin-9 expression and release in Jurkat T cell line cells［J］.Glycobiology，2002，12(2):111

［8］Liang M，Oomizu S，Arikawa T，et al.Galectin-9 expression links to malignant potential of cervical squamous cell carcinoma［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2008，134(8):899

［9］向江東，席曉薇.半乳凝素-9與腫瘤［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18(5):1014

［10］Kageshita T，Kashi? Y，Yamauchi A，et al.Possible role of galectin-9 in cell aggregation and apoptosis of human melanoma cell lines and its clinical significance［J］.Int J Cancer，2002，99(6):809

［11］Yamauchi A，Kontani K，Kihara M，et al.Galectin-9，a novel prognostic factor with antimetastatic potential in breast cancer［J］.Breast J，2006，12(5 Suppl 2):S196

［12］Wang X，Lu N，Niu B，et al.Overexpression of aurora-A enhances invasion and matrix metalloproteinase-2 expression in esophageal squamous cell carcinoma cells［J］.Mol Cancer Res，2012，10(5):588

［13］Groblewska M，Siewko M，Mroczko B，et al.The role of matrix metalloproteinases(MMPS)and their inhibitors (TIMPS)in the development of esophageal cancer［J］.Folia Histochem Cytobiol，2012，50(1):12

Relationship between prognosis and expressions of Galectin-9 and MMP-2 in esophageal squamous cell carcinoma tissue

GUO Suping1)，MA Jun2)，TANG Fu'ai1)，LU Di1)，DUAN Fangling2)，GUO Qi1)1)Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500142)Digestive Disease Institute，the Second Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450014

esophagus neoplasm;squamous cell carcinoma;tissue microarray;Galectin-9;MMP-2;prognosis

Aim:To explore the expressions of Galectin-9 and MMP-2 proteins，and the relationship between their expressions and prognosis of the patients with esophagus squamous cell carcinoma(ESCC).Methods:The expressions of Galectin-9 and MMP-2 proteins in 63 cases of ESCC and adjacent non-tumor tissue were detected using tissue microarray and immunohistochemical technique.The association of Galectin-9 and MMP-2 protein expressions with clinicopathologic data and survival were analyzed.Results:The positive expression rate of Galectin-9 protein in adjacent non-tumor tissue and ESCC tissue were 89.3%and 62.5%，and there was significant difference(χ2=11.529，P＜0.001).In ESCC，its expression was related with tumor differentiation(P=0.001).The patients with Galectin-9 positive expression had a longer survival period(P=0.013).The positive rate of MMP-2 protein in adjacent non-tumor tissue and ESCC tissue were 35.7%and 67.9%，and there was significant difference(χ2=9.633，P=0.001).In ESCC，the expression of MMP-2 was related with tumor invasion，lymph node metastasis，and clinical stage，and patients with MMP-2 positive expression showed a shorter survival period(P=0.036).Conclusion:In ESCC，the Galectin-9 protein is down-regulated and MMP-2 is up-regulated.Galectin-9 and MMP-2 could be markers for prognostic diagnosis of ESCC.

R735.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.001

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃普通項目 200903060

(2012-02-04收稿 責(zé)任編輯徐春燕)