李 茂，字學(xué)娟,3，周漢林， 劉國道

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶草業(yè)與畜牧研究所，海南 儋州 571737； 3.海南大學(xué)應(yīng)用科技學(xué)院(儋州校區(qū))，海南 儋州 571737)

后生物生產(chǎn)層

新銀合歡中單寧提取工藝優(yōu)化研究

李 茂1,2，字學(xué)娟1,2,3，周漢林1,2， 劉國道1,2

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶草業(yè)與畜牧研究所，海南 儋州 571737； 3.海南大學(xué)應(yīng)用科技學(xué)院(儋州校區(qū))，海南 儋州 571737)

對新銀合歡(Leucaenaleucocephala)中單寧類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，選擇液料比、提取溫度、提取時間、提取劑體積分?jǐn)?shù)等因素分別進(jìn)行單因素和正交試驗。結(jié)果表明，在液料比40∶1、提取溫度50 ℃、提取時間60 min、丙酮體積分?jǐn)?shù)50%的條件下，單寧提取效果最佳，測得新銀合歡單寧平均含量為2.54%。

新銀合歡；單寧；提取

新銀合歡(Leucaenaleucocephala)為豆科含羞草亞科銀合歡屬多年生灌木或喬木，是我國一種重要的木本豆科飼用植物[1]。新銀合歡葉片干物質(zhì)中粗蛋白質(zhì)含量為22%～29%，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織的飼料專家譽(yù)為干旱地區(qū)的“蛋白質(zhì)倉庫”；且氨基酸、胡蘿卜素、多種維生素和微量元素含量豐富，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向亞太地區(qū)推廣的多用途優(yōu)良樹種之一[1]。1961年8月華南熱帶作物科學(xué)研究院(現(xiàn)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院)從中美洲引進(jìn)少量薩爾瓦多型銀合歡種子，1962年開始試種觀察，繁殖種子[2]。

單寧(Vegetable tannin)是指存在于植物體內(nèi)的多元酚類物質(zhì)，并可與蛋白質(zhì)、生物堿和多糖等化合物發(fā)生反應(yīng)，是一種保護(hù)性物質(zhì)[3-4]。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，單寧一般被當(dāng)作飼料的抗?fàn)I養(yǎng)因子，特別在熱帶亞熱帶木本飼用植物中含量較高，影響動物的采食和消化。國內(nèi)許多學(xué)者已經(jīng)從紫花苜蓿(Medicagosativa)、檳榔果(Arecacatechu)、紅豆草(Onobrychisviciaefolia)、山螞蝗屬(Desmodium)、決明(Cassianictitoms)等植物中提取單寧或進(jìn)行相關(guān)研究[5-9]，而新銀合歡的研究主要集中在其栽培技術(shù)、營養(yǎng)價值和含羞草素上[10-13]，對其單寧的提取研究較少。本研究建立了新銀合歡中單寧的優(yōu)化提取工藝，為科學(xué)利用新銀合歡資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料 供試所用新銀合歡(開花期)新鮮嫩莖葉，采集于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所實驗基地(海南省儋州市)。樣品經(jīng)殺青后烘干、過80目篩粉碎備用。

1.1.2試劑 單寧酸(C76H52O46)、磷鉬酸、鎢酸鈉、磷酸、無水碳酸鈉、無水乙醇、丙酮、甲醇。

Folin-Denis 顯色劑：10 g磷鉬酸，50 g鎢酸鈉溶于750 mL 蒸餾水中，再加入50 mL 85%的磷酸，煮沸后回流2 h，冷卻定容至 1 000 mL，保存于棕色瓶中。

飽和 Na2CO3溶液：35 g 無水Na2CO3加熱溶解于100 mL水中，冷卻晶體后用快速濾紙過濾，溶液備用。

1.1.3儀器 723PCS可見分光光度計(上海欣茂儀器有限公司)和CHZ-82A 恒溫振蕩器(金壇市富華儀器有限公司)。

1.2方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及單寧提取方法參照字學(xué)娟[14]的方法。

1.2.1提取劑的選擇 選用蒸餾水、50%(V/V)丙酮、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液，按液料比為50∶1、40 ℃、40 min的條件分別進(jìn)行提取，測定單寧的含量。

1.2.2單因素試驗 選擇丙酮體積分?jǐn)?shù)、浸提時間、浸提溫度和液料比進(jìn)行單因素試驗。丙酮體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為20%、30%、40%、50%、60%、70%；浸提時間為20、30、40、50、60和70 min；浸提溫度分別設(shè)置為室溫(約20 ℃)、30、40、50、60和70 ℃；液料比分別設(shè)置為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1和70∶1。

1.2.3正交試驗 為了驗證各單因素間的相互作用效果,選用對單寧提取影響較大的提取劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度4個因素進(jìn)行4因素3水平L9(34)正交試驗,確定提取新銀合歡中單寧的最佳工藝參數(shù)。

1.2.4回收、重復(fù)性試驗 稱取銀合歡20份各1 g，按正交試驗結(jié)果中最佳工藝制備浸提液，其中10份樣品浸提液中加入不等量的單寧，對加入單寧的量進(jìn)行回收試驗?；厥章?(加單寧后測得單寧含量-未加單寧測得單寧含量)/加入單寧含量×100%。根據(jù)兩種處理試驗結(jié)果進(jìn)行重復(fù)性比較。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 采用SAS軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，方差分析(ANOVA)過程中均值的多重比較采用Duncan法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1提取條件對單寧提取的影響性

2.1.1提取溶劑對新銀合歡中單寧提取的影響 選用去離子水、50%(V/V)丙酮、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液，按液料比為50∶1、40 ℃、40 min的條件進(jìn)行提取，測定單寧的含量(圖1)。

圖1 不同提取溶劑對新銀合歡中單寧的提取量Fig.1 Effects of extraction solvent on tanninextraction from Leucaena leucocephala

丙酮溶液提取效果最好，甲醇和乙醇提取單寧含量相近，去離子水提取效果最差。甲醇是有毒試劑，使用時易造成安全隱患。在使用乙醇溶液提取的過程中發(fā)現(xiàn)，浸提溶液較混濁，過濾十分困難，不利于后續(xù)處理。所以選擇對單寧溶解性好、提取率高的丙酮溶液作為提取劑。

2.1.2提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對新銀合歡中單寧提取的影響 分別用20%、30%、40%、50%、60%、70%丙酮溶液提取，提取溫度40 ℃，液料比為50∶1，提取40 min，過濾、定容,測定單寧含量(圖2)。

圖2 提取溶劑濃度對新銀合歡中單寧提取的影響Fig.2 Effects of acetone concentration on tannin extraction from Leucaena leucocephala

40%丙酮溶液對單寧的溶解能力最強(qiáng),丙酮體積分?jǐn)?shù)高于或低于40%時提取率有所下降。這與丙酮的理化性質(zhì)有關(guān)，加入適量的水比純丙酮溶液對單寧的提取量要高，可顯著改善單寧提取效果[15]。

2.1.3提取時間對新銀合歡中單寧提取的影響 提取時間分別為20、30、40、50、60和70 min,用50%丙酮溶液、在溫度40 ℃、液料比為50∶1提取、過濾、定容，測定單寧含量(圖3)。

圖3 提取時間對新銀合歡中單寧提取的影響Fig.3 Effects of extraction time on tannin extraction from Leucaena leucocephala

隨著提取時間的增加，新銀合歡中單寧含量也有所增加，50 min處理單寧含量最高，而后逐漸下降)。說明經(jīng)過一段時間(約50 min)的提取后樣品與浸提溶液中單寧含量趨于平衡，即已達(dá)到浸提最大值。單寧是多酚類物質(zhì)，丙酮具有一定的氧化性，時間過長可能使單寧部分氧化，導(dǎo)致單寧含量下降。

2.1.4提取溫度對新銀合歡中單寧提取的影響 在相同條件下(50%丙酮、40 min、50∶1液料比)，分別在室溫(約20 ℃)、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下提取，過濾定容后，測定單寧含量(圖4)。

圖4 提取溫度對新銀合歡中單寧提取的影響Fig.4 Effects of temperature on tannin extraction from Leucaena leucocephala

隨著提取溫度的增加,新銀合歡中單寧含量也有所增加,50 ℃時單寧含量最高，當(dāng)溫度繼續(xù)增高時單寧含量逐漸降低。這是由于溫度較低時，溫度的增高促進(jìn)單寧在丙酮中的溶解，提取的單寧含量逐漸增加。但是過高溫度單寧易發(fā)生降解、縮合、氧化等化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致提取的單寧含量下降。另外高溫會加快丙酮的揮發(fā)，增加了成本。

2.1.5液料比對新銀合歡中單寧提取的影響 在相同條件下(50%丙酮、40 min、40 ℃)，分別在液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1和70∶1下提取，過濾定容后，測定單寧含量，得單寧含量與液料比的關(guān)系(圖5)。

圖5 液料比對新銀合歡中單寧提取的影響Fig. 5 Effects of liquid-material ratio on tannin extraction from Leucaena leucocephala

隨著液料比的增加,新銀合歡中單寧含量也有所增加,液料比為50∶1時單寧含量最高(略高于液料比40∶1的單寧含量)，當(dāng)液料比大于50∶1時，單寧含量逐漸減少。可能是由于液料比過低時樣品與提取液攪拌不均勻，影響了單寧的提取；而液料比過高(即丙酮溶液較多)則增加了單寧的氧化機(jī)會，也可能造成提取的單寧含量低。

2.2新銀合歡中單寧提取的正交試驗 通過單因素試驗確定了單寧提取率的主要影響因素為丙酮體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度和液料比，進(jìn)行正交試驗探討提取的最佳工藝條件，試驗因素和水平見表1。

極差分析可知，4個因素的極差大小為Dgt;Cgt;Bgt;A(表2)，液料比對單寧的提取影響最大，提取時間的影響較小。通過極差分析最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即液料比為40∶1、溫度為50 ℃、提取時間為60 min、丙酮濃度為50%，此時提取的單寧為2.566 1%。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 單寧回收和重復(fù)性測定結(jié)果Table 3 Measurement of tannin recycling and reproducibility

2.3新銀合歡中單寧提取最優(yōu)組合的重復(fù)性和回收分析 通過最優(yōu)組合測得單寧含量平均值為2.54%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.03，表明該方法重復(fù)性較高；單寧回收率在0.93～1.13，標(biāo)準(zhǔn)差為0.06，回收率較高。

3 討論與結(jié)論

單寧類化合物多采用有機(jī)溶劑或水提取，但各有優(yōu)缺點，純有機(jī)溶劑提取單寧，可能導(dǎo)致組分不完全[16]；而水的極性較大，溶液雜質(zhì)多，不利于下一步分離，故一般很少單獨使用有機(jī)溶劑或水。前人研究[17]結(jié)果表明，單寧在有機(jī)溶劑的水溶液中溶解度更大，例如丙酮、乙醇、甲醇等的水溶液。本試驗中使用甲醇、乙醇、丙酮水溶液提取單寧，發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇提取單寧的量相當(dāng)，丙酮水溶液提取單寧含量最高。由于甲醇為有毒試劑，乙醇為易燃易爆化學(xué)品，應(yīng)用前景受限。而丙酮水溶液對單寧的溶解能力很強(qiáng)，能打開單寧―蛋白質(zhì)的連接鍵，使單寧的提取率提高[18]，綜合各方面因素考慮，最終選用丙酮作為提取劑。

由單因素試驗和正交試驗結(jié)果，新銀合歡中單寧的最佳提取條件為液料比40∶1、提取溫度50 ℃、提取時間60 min、丙酮體積分?jǐn)?shù)50%的單寧提取結(jié)果最佳，通過重復(fù)性和回收試驗，新銀合歡單寧平均含量為2.54%。

[1] 劉國道.世界銀合歡研究進(jìn)展[J].熱帶作物研究,1995(2):78-81.

[2] 蔣候明,邢治能,何華玄.新銀合歡引種栽培成功[J].熱帶作物研究,1982(3):66-72.

[3] Benner R,Weliky K,Hedges J I.Early diagenesis of mangrove leaves in a tropical estuary:molecular-level analyses of netural sugars and lignin-derived phenols[J].Geochimica et Cosmochimica Acta,1990,54:1991-2001.

[4] Hernes P J,Benner R,Cowie G L,etal.Tannin diagensis in mangrove leaves from a tropical estuary:a novel molecular approach[J].Geochimica et Cosmochimica Acta,2001,65:3109-3122.

[6] 張春江,呂飛杰,臺建祥,等.檳榔果及其制品中總酚和單寧含量的測定[J].食品研究與開發(fā),2008,29(6):119-121.

[7] 張曉慶,郝正里,李發(fā)弟,等.紅豆草縮合單寧對綿羊瘤胃代謝及飼糧尼龍袋降解率的影響[J].草業(yè)學(xué)報,2010,19(1):166-172.

[8] 陳艷琴,周漢林,劉國道.山螞蝗飼料資源研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2010,27(10):173-178.

[9] 王俊宏,李艷春,陳志彤,等.氮素對羽葉決明縮合單寧及相關(guān)酶活性的影響[J].草業(yè)科學(xué),2010,27(2):99-103.

[10] 曾憲海,王真輝,謝貴水,等.幼齡膠園間種新銀合歡對膠樹生長和土壤肥力影響[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2001(4):1-3,9.

[11] 汪儆,雷祖玉,馮學(xué)勤,等.熱帶、亞熱帶牧草銀合歡的開發(fā)利用——潿洲島黃牛、山羊瘤胃液的接種轉(zhuǎn)移及我國DHP降解細(xì)菌資源的發(fā)現(xiàn)[J].草業(yè)科學(xué),1992,9(1):20-23.

[12] 劉福平.含羞草素及其代謝產(chǎn)物的降解和銀合歡去毒[J].亞熱帶植物通報,1997,26(1):38-42.

[13] 陳秀蘭,洪彩香.降低銀合歡含羞草素的處理方法研究[J].熱帶作物研究,1986(2):73-75.

[14] 字學(xué)娟.熱帶喬灌木飼用價值評定及其單寧含量動態(tài)分析[D].儋州：海南大學(xué),2010.

[15] 楊連利,李仲瑾,元寶楓.單寧類化合物的提取研究[J].皮革化學(xué),1999,21(5):1-3.

[16] Quinsac A,Lessire M,Krouti M.Improvement in the nutritive value of high and low glucosinolates rapeseed meal by aqueous extraction [J].Animal Feed Science and Technology,1994,48:265-272.

[17] 黃占華,方桂珍.植物單寧的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].林產(chǎn)化工通訊,2005,39(5):39-43.

[18] 朱加進(jìn).苦菜中單寧提取工藝及其抗便秘作用的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2003,19(2):186-189.

OptimumconditionsonextractionoftanninfromLeucaenaleucocephala

LI Mao1,2, ZI Xue-juan1,2,3, ZHOU Han-lin1,2, LIU Guo-dao1,2

(1.Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737，China; 2.Tropical Grassland and Animal Science Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China;3.College of Applied Science and Technology, Hainan University, Danzhou 571737, China)

The optimum conditions, including four main factors: ratio of liquid to material, extraction temperature, extraction time and extractant concentration, for extracting tannins from leaves and stems ofLeucaenaleucocephalawere optimized by using a combined method of single factor analysis and orthogonal experiment design. The results showed that the optimum conditions of each factor in tannin extraction were: ratio of liquid to material 40∶1, extraction temperature 50 ℃, extraction time 40 min and acetone concentration 50%. The extracting rate of the tannin from the leaves and stems ofL.leucocephalawas 2.54%.

Leucaenaleucocephala; tannins; extraction

ZHOU Han-lin E-mail:zhouhanlin8@163.com

Q946

A

1001-0629(2012)02-0301-05

2011-05-03 接受日期：2011-10-10

中央級公益科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(PZS066)；海南省重點科技項目(090103)；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2010GB23260578)

李茂(1984-)，男，四川綿陽人，碩士，研究實習(xí)員，主要從事熱帶牧草與反芻動物營養(yǎng)研究。

周漢林 E-mail:zhouhanlin8@163.com