茍小蘭 ，王 利 *，侯顯耀 ，龍鐘明 ，魏 勇 ，黃文明

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，動物遺傳育種學國家民委教育部重點實驗室，四川 成都 610041；2.四川省南充市畜牧局，四川 南充 637600；3.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066）

本試驗觀測了成都某丁鮭魚養(yǎng)殖場的發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)病魚主要表現(xiàn)為行動遲緩、體表鱗片大面積脫落、體表局部充血等癥狀，剖檢可見主要臟器已發(fā)生不同程度病變。從病魚體內(nèi)分離得到了一株細菌，采用細菌常規(guī)分離培養(yǎng)方法、16S rDNA序列擴增分析及構建系統(tǒng)進化樹，對該菌進行了鑒定和生物學特性研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 樣品來源 試驗魚來源于成都某丁鮭魚養(yǎng)殖場，體長6.0cm，體重15.0g。

1.2 主要儀器及試劑 PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)；生化鑒定藥品均購于杭州微生物試劑有限公司，麥康凱瓊脂（北京奧博星生物技術有限責任公司生產(chǎn)），營養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物技術有限責任公司生 產(chǎn)），TaqMix、DNA Marker DL2000， 購 自 Tiangen Biotech（Beijing）。

1.3 細菌分離培養(yǎng) 無菌操作下分別挑取丁鮭魚腎臟、肝臟、心臟組織于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，選取形態(tài)均一的優(yōu)勢菌群，挑取單菌落反復劃線純化，純化所得菌株于4℃保存。再將保存菌株劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，挑取單個菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4 生理生化鑒定 將純培養(yǎng)菌株穿刺接種于細菌生化特性鑒定管中，參照生化反應管使用說明書，對分離純化培養(yǎng)物進行鑒定。

1.5 16S rDNA基因的擴增和測序 挑取單個菌落于滅菌水中，-80℃凍存1h后，立即置于100℃沸水浴20min，然后4℃ 12000r/min離心5min，取上清液作為PCR模板。采用細菌16S rDNA通用引物：上游引物 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTTAG-3′，下游引物 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，進行PCR體外擴增，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。50μL反應體系中含有：模板4μL，上游引物、下游引物各2μL（引物濃度均為 10 μmol/L），Taq Mix 25 μL，ddH2O 19μL。PCR反應程序：94℃預變性4min；94℃ 30s、60℃30s、72℃ 4min，5 個循環(huán)；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃4min，5 個循環(huán)；94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 4min，30 個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性樣品送交北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 利用Blastn系統(tǒng)對分離菌株的16S rDNA序列與GenBank中的相關親近物種進行同源性檢索，找出相似性最高的菌株及同屬菌株作為內(nèi)群，另選取弧菌（Vibrio）作外群。運用ClustalX2.0軟件進行多序列比對，再用MEGA5.0軟件包中的Neighbour-Joining法構建系統(tǒng)進化樹，采用Kimura 2-parameter作為校正模型，自舉1000次（Boostrap）進行置信度檢測。

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng) 從被檢丁鮭魚的腎臟、肝臟、心臟組織分離純化培養(yǎng)得到形態(tài)均一的細菌，該菌在LB培養(yǎng)基上生長良好，其表面略有菌膜。在麥康凱培養(yǎng)基上經(jīng)28℃培養(yǎng)20h后，菌落呈現(xiàn)出表面光滑濕潤、圓形、向上隆起、邊緣整齊、乳白色。營養(yǎng)瓊脂平板上可觀察到灰白色半透明濕潤菌落。革蘭氏鏡檢表明，該菌為革蘭氏陰性桿菌，菌體呈兩端鈍圓，多單個或兩兩并排存在。

2.2 生理生化鑒定 菌株XN602具動力性；不發(fā)酵鼠李糖、側(cè)金盞花醇、山梨醇等；H2S、尿素、蛋白胨水呈陰性；β-半乳糖苷酶、VP試驗、檸檬酸鹽等呈陽性，其他生理生化特性見表1。參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》，初步判定該菌株為維氏氣單胞菌。

表1 分離菌生化鑒定結果

2.3 16S rDNA基因擴增 以菌株XN602為模板，對其16S rDNA通用引物進行體外擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，最終擴增出長度大小約為1500bp的PCR產(chǎn)物，結果見圖1。經(jīng)由六合華大基因科技股份有限公司測序，得到實為1468bp大小的PCR產(chǎn)物片段，將此序列提交至GenBank（登錄號為JQ013893）Blastn程序比對分析，顯示菌株XN602的16S rDNA擴增產(chǎn)物與GenBank中維氏氣單胞菌分離株的相似性最高達99%。

圖1 菌株XN602 16S rDNA基因PCR擴增產(chǎn)物

2.4 系統(tǒng)進化分析 選取相似度較高的同種菌株及相關同屬菌株運用ClustalX2.0與MEGA5.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，結果如圖2所示。分離菌株的Bootstrap自舉檢驗值達1000次，同時在系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出分離細菌XN602（圖中用“●”標注）與氣單胞菌屬聚為一個類群，且與維氏氣單胞菌聚為一個分支，明顯同弧菌屬分開，由此可推斷此次分離得到的細菌為維氏氣單胞菌（A.veronii）。

圖2 菌株XN602 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 討論

3.1 維氏氣單胞菌又被稱為維羅納氣單胞菌、凡隆氣單胞菌和維隆氣單胞菌，該菌為近年來發(fā)現(xiàn)鑒定的一個新種氣單胞菌。已知維氏氣單胞菌普遍存在于各種水體、淤泥等環(huán)境中，廣泛分布于世界各地。其中一部分菌株在微生態(tài)環(huán)境中能正常存在，而另一部分菌株如嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌等則具有強的致病性，可引起水產(chǎn)動物的大量死亡。已有報道證實維氏氣單胞菌是感染鯰魚、西伯利亞鱘、中華絨鰲蟹、鏡框鯉、錦鯉、斑點叉尾鮰等的主要細菌之一。最近有研究表明該類菌可感染人體，通常引起患者發(fā)生急性腹瀉，也可引起菌血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等疾??；也有報道稱維氏氣單胞菌能引起人類肺炎。眾多實驗及病例表明維氏氣單胞菌已成為一種人魚共患的致病菌，已對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康逐漸構成了嚴重的威脅。

3.2 從患病丁鮭魚中分離得到了菌株XN602，根據(jù)對細菌的形態(tài)學特征、生理生化特性等鑒定初步確定為維氏氣單胞菌，但菌株XN602又與維氏氣單胞菌的模式菌株存在一定差異，如鳥氨酸呈陽性、精氨酸呈陰性等，因而不能對分離菌進行準確的判定。近年來隨著分子生物學的發(fā)展，科研工作者將基于16S rRNA的分析方法引入到原核生物分子層次的鑒定后，該方法已逐步得到完善。目前，16S rDNA序列分析已廣泛應用于水產(chǎn)動物病原菌的鑒定中，進一步提高了細菌鑒定的準確性與高效性。本試驗采用一對通用引物擴增出了菌株XN602的16S rDNA片段,并對其序列進行了分析，將所獲得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的微生物16S rDNA序列進行同源性比對，得出該菌與維氏氣單胞菌的同源性高達99%。在系統(tǒng)進化樹上該菌株顯示與其他維氏氣單胞菌聚為一簇，從分子生物學水平上鑒定了分離菌株XN602為維氏氣單胞菌。

3.3 本試驗中，根據(jù)細菌表型特征、生理生化鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學結果，可判定菌株XN602是維氏氣單胞菌。而進化樹上每個聚群內(nèi)部之間的遺傳距離很相近，反應了其親緣關系較近，但又有差別，這在一定程度上表明了相同菌種在不同物種、不同環(huán)境間又具有一定的差異性。16S rDNA分子鑒定具有快速、簡便的優(yōu)點，但對于相近種的區(qū)分也有一定的困難；另外，GenBank中16S rDNA基因序列的數(shù)量也有限，而且未經(jīng)過嚴格的篩選及檢驗，序列的正確與否也可能限制16S rDNA鑒定方法的準確性。綜上所述，在魚類細菌的分類鑒定中最好采用多種方法，從不同的研究水平和層次描述細菌的不同特征，從而提高鑒定菌株的準確性。

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