宋 宇，黃 勇

（1.四川省樂山市市中區(qū)畜牧食品局，四川 樂山 614000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014）

魏氏梭菌病是危害養(yǎng)兔業(yè)的重要疾病，α毒素是該菌的主要致病因子且具有較好的免疫原性。目前關(guān)于魏氏梭菌α毒素抗體的間接ELISA檢測方法報(bào)道較少，本文在對家兔魏氏梭菌分離鑒定的基礎(chǔ)上，對該菌主要的毒素——α毒素進(jìn)行基因擴(kuò)增、克隆和表達(dá)，并以表達(dá)產(chǎn)物為抗原，建立檢測抗α毒素抗體的間接ELISA方法，為家兔魏氏梭菌疫苗的評價(jià)提供實(shí)驗(yàn)室檢測手段。

1 材料

1.1 病料來源 四川省某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的300只家兔，突然發(fā)病，發(fā)病兔為35～115日齡，以急性腹瀉、排黑色水樣或帶血的膠凍樣糞便、盲腸漿膜出血斑和胃黏膜出血、潰瘍?yōu)橹饕卣?，并出現(xiàn)死亡。

1.2 試劑 革蘭氏染色液、PCR反應(yīng)試劑、DNA Marker、T4DNA 連接酶、溶菌酶、EcoRI、HindⅢ，均購自大連寶生物工程公司；藥敏試紙購自杭州微生物試劑有限公司；低分子質(zhì)量蛋白Marker購自博瑞克公司；其他常規(guī)試劑均為國內(nèi)生產(chǎn)；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自博瑞克公司；牛血清蛋白（BSA）為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 載體 PMD19-T載體購自大連寶生物工程公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 E.coli DH5α、BL21（DE3）、表達(dá)載體PET-32a（+），由川農(nóng)大動物學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 儀器 恒溫?fù)u床、厭氧培養(yǎng)箱、顯微鏡、PCR儀、核酸電泳槽、臺式離心機(jī)、超凈工作臺、BIO RAD凝膠成像系統(tǒng)，mini渦旋振蕩器等，恒溫水浴鍋（±0.5℃），臺式冷凍離心機(jī)、96孔ELISA酶標(biāo)板，均購自Bio Rad公司。

2 方法

2.1 染色鏡檢 將無菌采取的病料觸片，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌操作,取病死兔肝臟病料劃線接種于鮮血瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)24～48h，觀察菌落特征。挑選疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色。

2.3 細(xì)菌的純化 在鮮血瓊脂平板上釣取魏氏梭菌的可疑菌落接種于厭氧肉肝湯中，進(jìn)行可疑魏氏梭菌的進(jìn)一步純化。將純化后的菌種放入-20℃冰箱中凍干保存。

2.4 生化試驗(yàn)鑒定 挑選純化后的鮮血瓊脂平板上的單個(gè)典型菌落，接種于各糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24～48h后，觀察發(fā)酵情況。另外，挑選純化后的鮮血瓊脂平板上單個(gè)典型菌落，接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基中，觀察牛乳“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象。生化結(jié)果判定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行。

2.5 PCR鑒定

2.5.1 細(xì)菌模板DNA的提取 將待鑒定的菌株于LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)16～18 h，取1 mL細(xì)菌的過夜培養(yǎng)物至離心管，13000r/min離心30s，棄去上清，再加入100 μL滅菌雙蒸水混勻，煮沸15 min，13 000r/min離心30s后取上清作模板。

2.5.2 半套式PCR引物設(shè)計(jì) 運(yùn)用DNAstar軟件,根椐GenBank發(fā)表的α毒素基因序列自行設(shè)計(jì)3條引物，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，引物序列如下:

引物1：TGTTACTGCCGTTGATAGCG，位于α毒素基因 501～520nt位；引物 2：TTGTCCATTTCCCATTC TTG，位于α毒素基因946～965nt位；引物3：CCTCTG ATACATCGTGTAAG，位于α毒素基因801～820nt位。

先用引物1和引物2擴(kuò)增α毒素基因，然后用引物1和引物3對該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。引物1和引物2擴(kuò)增長度為464 bp，引物1和引物3擴(kuò)增長度為319 bp。

2.5.3 PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)體系為50μL，基本反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 5.0μL；引物（25μmol/L）各1.0μL；dNTP（2.5 mM）4.0μL；MgCl2（25 mM）4.0μL；rTaq酶（5U/μL）0.25μL；模板DNA 5.0μL；雙蒸水29.75μL?；痉磻?yīng)程序如下：94℃ 5min、94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 1min，30 個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸 10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，于0.8%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL Gold View）中電泳檢測結(jié)果。

先用引物1和引物2擴(kuò)增α毒素基因，然后以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，取1μL用于引物1和引物3的半套式PCR鑒定。

2.6 耐藥性鑒定 選用臨床常用藥物對分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)（12種臨床常用藥物），方法采用藥敏紙片法進(jìn)行。

2.7 α毒素基因的擴(kuò)增

2.7.1 引物合成 用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對表達(dá)用的引物。在α毒素基因的上、下游引物間分別引入EcoRI和HindⅢ酶切位點(diǎn)，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，表達(dá)引物如下：

上游引物：5′-CCGGAATTCACTCAAGGGGTTTCA ATCT-3′；下游引物：5′-CCCAAGCTTTTAGTTGTCCAT TTCCCATTCTTG-3′。

2.7.2 細(xì)菌的增殖及細(xì)菌基因組提取 取1 mL細(xì)菌的過夜培養(yǎng)物至離心管，13000r/min離心30s，棄去上清，再加入100 μL滅菌雙蒸水混勻，煮沸15 min，13 000r/min離心30s后取上清作模板。

2.7.3 α毒素基因片段的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為 50 μL，基本反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 5.0μL，dNTP mixture（2.5mmol/L）4.0μL，MgCl2（25mmol/L）4.0 μL，Taq plus DNA 聚合酶 （5.0 U）0.5 μL，DNA 2.0μL，引物（20mmol/L）各 2.0μL，滅菌 dH2O 30.5μL?；痉磻?yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s、51℃退火 1min、72℃延伸 3min，33個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR完成后，于0.8%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL Gold View）中電泳檢測結(jié)果。

2.7.4 α毒素基因片段的克隆及鑒定

2.7.4.1 α毒素基因 PCR產(chǎn)物的回收與純化 按上海生物工程有限公司DNA膠回收試劑盒的說明書進(jìn)行。

2.7.4.2 α毒素基因PCR產(chǎn)物和PMD19-T載體的連接 參照大連寶生物公司的連接試劑盒方法進(jìn)行。

2.7.4.3 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5α 取感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化后，加入10μL連接產(chǎn)物，混勻后，冰浴30min。42℃熱沖擊90s，冰浴2min，使之冷卻。加入600μL LB混勻，220r/min、37℃搖床培養(yǎng)1h。吸取200μL培養(yǎng)液，涂布在對應(yīng)的抗性平板上。37℃培養(yǎng)12～16h至單菌落出現(xiàn)。

2.7.4.4 轉(zhuǎn)化子的篩選及提取 參照北京賽百盛基因技術(shù)有限公司的質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒上的方法提取陽性菌株的質(zhì)粒。

2.7.4.5 重組質(zhì)粒的PCR鑒定 PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 5.0μL，4×dNTP（2.5mmol/L）4.0 μL，引物（20 mmol/L）各 1.0 μL，重組質(zhì)粒 DNA 1.0 μL，Taq plus DNA 聚合酶（5U）0.5μL，滅菌水 37.5μL，總體積50.0μL。按照2.7.3條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后于0.8%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL Gold View）中電泳檢測結(jié)果。

2.7.4.6 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定 10μL的反應(yīng)體系：重組子 1.0 μL，10×M Buffer 0.5 μL，HindⅢ 0.5 μL，EcoRI 0.5μL，超純水 7.5μL。37℃溫浴 2h，然后終止反應(yīng)，取 5 μL酶切產(chǎn)物與 5 μL Maker DL2000經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切片段大小。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為PMD19-T-α。

2.7.4.7 目的基因的序列測定 陽性重組質(zhì)粒PMD19-T-α的序列測定交由上海生物工程有限公司完成。

2.8 α毒素基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.8.1 α毒素基因片段與PET-32a（+）載體的酶切回收 雙酶切反應(yīng)體系為40μL，其組成如下：10×限制性內(nèi)切酶緩沖液（buffer M）4.0 μL，EcoRI（12 U/gL）2.0 μL，HindⅢ（12U/pL）2.0μL，滅菌水 20.0 μL，質(zhì)粒12.0μL。將各成分加好后離心混合均勻，置37℃水浴消化 2 h，加 10×loading buffer 2.0 μL，用 1.0 g/L 瓊脂糖凝膠電泳重組質(zhì)粒和載體酶切產(chǎn)物，切下所需的目的條帶，用Agarose Gel DNA extraction kit回收純化目的片段和載體片段（按上海生物工程有限公司DNA膠回收試劑盒的說明書進(jìn)行），電泳觀察回收情況。

2.8.2 α毒素基因片段與表達(dá)載體的連接與轉(zhuǎn)化 參照文獻(xiàn)進(jìn)行。

2.8.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的提取 參照北京賽百盛基因技術(shù)有限公司的質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒上的方法提取陽性菌株的質(zhì)粒。

2.8.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒按1∶10倍稀釋后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

2.8.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定 α毒素基因的重組表達(dá)質(zhì)粒用EcoRI和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物以1.0g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.8.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的序列測定 重組表達(dá)質(zhì)粒的測序：將鑒定為陽性克隆的菌液送到上海生物工程公司測序確證，并將鑒定為陽性的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為PET-32a（+）-α。

2.9 重組表達(dá)質(zhì)粒菌株的構(gòu)建 將鑒定后的重組表達(dá)質(zhì)粒 PET-32a（+）-α 轉(zhuǎn)化為表達(dá)菌株 BL21（DE3），并進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化重組子的鑒定。

2.10 重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 分別將各重組表達(dá)菌在37℃振搖過夜，取過夜培養(yǎng)物200 μL接種于20 mL LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100μg/mL）中，劇烈振搖至OD600為0.6~1.0時(shí)，取1mL另行培養(yǎng)不進(jìn)行誘導(dǎo)；其余菌液加入IPTG至終濃度 0.6mmol/L，37℃繼續(xù)劇烈振蕩培養(yǎng)4～6h左右。取IPTG誘導(dǎo)后的菌液1mL，離心，棄上清，沉淀用滅菌雙蒸水洗滌，然后加入100μL滅菌雙蒸水及5×SDS上樣緩沖液25μL，100℃煮沸10min，離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE；對未誘導(dǎo)菌液亦作同樣處理，觀察表達(dá)情況。同時(shí)，以LB液體培養(yǎng)空載體 PET-32a（+）轉(zhuǎn)化的 BL21（DE3）作為對照，具體操作同上。

2.11 表達(dá)產(chǎn)物的檢測

2.1 1.1 SDS-PAGE電泳 參照文獻(xiàn)進(jìn)行。

2.1 1.2 Western blotting分析 參照文獻(xiàn)步驟進(jìn)行。

2.1 1.3 PET-32a（+）-α表達(dá)蛋白產(chǎn)物的初步純化 參照文獻(xiàn)進(jìn)行。

2.12 魏氏梭菌類毒素疫苗的制備及檢驗(yàn)

2.1 2.1 α毒素的粗提 魏氏梭菌復(fù)壯：將已鑒定保存的兔魏氏梭菌菌株接種于鮮血瓊脂平板，使其復(fù)活，37℃厭氧培養(yǎng)24h。然后挑取典型單個(gè)菌落接種于厭氧肉肝湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，42℃厭氧振蕩培養(yǎng)18~24 h。此菌液作為制備疫苗的菌種。疫苗菌液的制備：將復(fù)壯后的魏氏梭菌按3%～4%接種于肉肝胃膜湯（按培養(yǎng)基總量的1%加入10%硫乙醇酸鈉溶液，并按總量的 5%加入 7.5%碳酸氫鈉溶液，調(diào) pH 至 7.8～8.0），37℃厭氧振蕩培養(yǎng)5～6h，收獲菌液。α毒素的提?。喝∩鲜雠囵B(yǎng)液在4℃下4000r/min離心30min，取上清液，再經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過濾，去除菌體，即得到粗制魏氏梭菌α毒素，4℃保存。

2.1 2.2 毒素的活性測定 用滅菌生理鹽水將毒素按100、10-1、10-2、10-3進(jìn)行倍比稀釋，然后每只小白鼠腹腔注射1 mL。小鼠分5組（對照組注射生理鹽水），3只/組，注射后觀察72h，記錄死亡情況，然后計(jì)算LD50。結(jié)果得出LD50為101.83 mL。

2.1 2.3 毒素的滅活 將制取好的毒素用1M NaOH調(diào)pH至7.2，然后加入0.3%甲醛，充分振蕩混勻，然后置37℃，進(jìn)行32h滅活，期間每隔5～6h振搖一次。

2.1 2.4 氫氧化鋁膠佐劑的制備 參照文獻(xiàn)進(jìn)行。

2.1 2.5 類毒素疫苗的制備 將滅活后的類毒素按9∶1的比例加入滅菌5%Al（OH）3膠，充分混合搖勻后，置4℃冰箱中自然沉淀10d，然后棄去1/3上清液進(jìn)行濃縮，并加入0.01%硫柳汞，混勻后4℃保存待檢。

2.13 基于α毒素基因重組蛋白檢測魏氏梭菌α毒素抗體的ELISA方法的建立

2.1 3.1 抗原濃度及一抗?jié)舛鹊倪x擇 將純化的重組蛋白用包被液作 1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280 稀釋，按方陣滴定式排列，微孔板每孔加100 μL，4℃包被過夜；甩棄液體，每孔加入封閉液100 μL，37℃封閉 30min；洗滌后，將制備的類毒素疫苗免疫的兔陽性血清及相應(yīng)的陰性血清分別用稀釋液作 1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640 稀釋上樣，在方陣滴定孔中每孔加100 μL，37℃封閉30min；洗滌液洗滌4次，拍干，每孔加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（作 1∶10000稀釋）100μL，37℃封閉 30min，洗滌液洗滌4次，拍干，每孔加入TMB 100 μL，避光顯色10min，加入終止液50 μL，輕拍混勻，用酶標(biāo)儀測OD450值。

2.1 3.2 臨界值的確定 隨機(jī)選取10份健康兔陰性血清按照上述確定好的重組蛋白抗原濃度和一抗?jié)舛扔冒灰合♂?，步驟按照2.13.1，最后用酶標(biāo)儀測定OD450值。將陰性血清OD450值的平均值設(shè)為X，求其標(biāo)準(zhǔn)差（設(shè)為S），取X+3S作為陽性血清的臨界值。當(dāng)被檢血清OD450值≥X+3S時(shí)，判定為陽性；被檢血清OD450值＜X+3S時(shí)，判定為陰性。其中標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性血清之差必須高于某定值，否則無效。

2.1 3.3 敏感性試驗(yàn) 表達(dá)蛋白按最佳包被濃度進(jìn)行包被，將制備的類毒素疫苗免疫的兔陽性血清作1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120、1∶10240 共 5 個(gè)稀釋度，其余條件按最適反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，觀察敏感性。

3 結(jié)果與分析

3.1 染色鏡檢 將病死兔的肝臟觸片、染色，在顯微鏡下可觀察到粗大、兩端鈍圓的桿菌，多單個(gè)存在，有明顯的莢膜，革蘭氏染色呈陽性。

3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 在鮮血瓊脂平板上可見灰白色、圓形、隆起的菌落，周圍有綠色溶血區(qū)，雙溶血環(huán)直徑一般在7～11mm，在鮮血瓊脂平板上能夠形成雙溶血環(huán)。

3.3 細(xì)菌的純化 在鮮血瓊脂平板上釣取魏氏梭菌的可疑菌落接種于厭氧肉肝湯中，可見病原菌繁殖非常迅速，采用厭氧肉肝湯快速移植法完成了疑似魏氏梭菌的進(jìn)一步純化。

3.4 生化試驗(yàn) 將病料中分離出的細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果表明：該細(xì)菌與魏氏梭菌的生化特性一致；將分離出的細(xì)菌接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基中，可觀察到“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象。

3.5 PCR鑒定 對樣品進(jìn)行檢測，先后用外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別擴(kuò)增出1條近500bp的特異性擴(kuò)增條帶（見圖1）和1條300bp左右的特異性擴(kuò)增條帶（見圖2）。

3.6 耐藥性測定 分離出的菌株對先鋒霉素和丁胺卡那比較敏感。

3.7 α毒素基因的擴(kuò)增、克隆和序列測定

3.7.1 α毒素基因的擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增的結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，其長度為837bp，與預(yù)期大小一致（見圖3）。

圖1 魏氏梭菌 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（外側(cè)引物）

圖2 魏氏梭菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（內(nèi)側(cè)引物）

3.7.2 α毒素基因的克隆與序列同源性分析 樣品測序得到α毒素基因837bp的序列片段。經(jīng)同源性分析，該序列與GenBank中的其他魏氏梭菌菌株的α毒素基因同源性高達(dá)99%。

圖3 α毒素基因PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果

3.7.3 生物信息學(xué)分析

3.7.3.1 二級結(jié)構(gòu)、疏水性、抗原決定簇以及表面抗原的預(yù)測 應(yīng)用DNAstar軟件對α毒素基因目的片段進(jìn)行分析，結(jié)果表明：α毒素基因目的片段的蛋白結(jié)構(gòu)主要呈無規(guī)則卷曲，并且這段目的片段蛋白集中了較多疏水區(qū)、抗原決定簇和表面位點(diǎn)，具有較強(qiáng)的抗原性。

3.7.3.2 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測 用在線網(wǎng)站htpp://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html分析全序列，得出α毒素基因目的片段的蛋白結(jié)構(gòu)沒有跨膜區(qū)，該基因親水性比較強(qiáng)。

3.7.3.3 抗原決定簇的預(yù)測 該蛋白序列在http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl上分析，可預(yù)測出其上含有11個(gè)抗原決定簇，分布于19～247aa之間，反導(dǎo)出α毒素基因目的片段上的抗原決定簇應(yīng)該位于57～741bp之間，且該段都具有較強(qiáng)的免疫原性。

3.8 α毒素基因在大腸桿菌中的原核表達(dá)

3.8.1 α毒素基因表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中不同時(shí)間段的誘導(dǎo)表達(dá) 在誘導(dǎo)1h時(shí)該基因就開始表達(dá)，在誘導(dǎo)4h后表達(dá)的量趨于穩(wěn)定。

3.8.2 α毒素基因表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中不同溫度下的誘導(dǎo)表達(dá) 結(jié)果表明該基因在30℃時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。

3.8.3 α毒素基因表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中不同IPTG濃度下的誘導(dǎo)表達(dá) 該基因在0.4 mmol時(shí)表達(dá)量趨于穩(wěn)定，從節(jié)約成本考慮，本實(shí)驗(yàn)采用IPTG的濃度為0.4mmol。

3.9 重組蛋白可溶性與不可溶性分析及初純結(jié)果 上清中很少看見目的蛋白，在沉淀中出現(xiàn)大量的目的蛋白，說明該蛋白主要以包涵體的形式存在。

圖4 Western blotting分析結(jié)果

3.10 Western blotting分析 轉(zhuǎn)印膜上可以看見一條和目的蛋白大小一致的條帶，見圖4。

3.11 基于α毒素基因重組蛋白檢測魏氏梭菌α毒素抗體的ELISA方法的建立

3.1 1.1 抗原濃度與一抗的選擇 根據(jù)抗原的某一稀釋孔P/N值最大的原則確定抗原最佳稀釋度，計(jì)算結(jié)果顯示：當(dāng)抗原稀釋度為1∶640時(shí)P/N值最大，故最佳抗原包被濃度為1∶640。根據(jù)血清的某一稀釋孔P/N值最大的原則確定血清最佳稀釋度，計(jì)算結(jié)果顯示：當(dāng)血清稀釋度為1∶80時(shí)P/N值最大，故最佳血清稀釋度為 1∶80。

3.1 1.2 臨界值的確定 用確定好的抗原濃度進(jìn)行包被，然后再通過對10份陰性血清進(jìn)行檢測，求得其平均值X為0.19，標(biāo)準(zhǔn)差S為0.038，確定陽性臨界值點(diǎn)為X+3S=0.30，即待檢測樣品的OD450值≥0.30為陽性，＜0.30則為陰性。

3.1 1.3 敏感性試驗(yàn) 采用已建立好的間接ELISA方法，以重組蛋白包被ELISA酶標(biāo)板，將陽性血清作1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240 共 5 個(gè)稀釋度，其余條件按最適反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，結(jié)果當(dāng)陽性血清稀釋到 1∶5120 時(shí)，OD450＞0.30。

4 結(jié)論

兔魏氏梭菌的診斷可根據(jù)兔群發(fā)病情況、臨床癥狀和病理變化作出初步診斷，但要確診需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷。通過病料的觸片鏡檢、病原的分離、病原的培養(yǎng)特性觀察和生化鑒定可對魏氏梭菌進(jìn)行鑒定，但是PCR方法在魏氏梭菌的鑒定中更具有特異性。

在間接ELISA方法建立之前，必須先確定魏氏梭菌α毒素抗原和抗體的最佳結(jié)合濃度。本試驗(yàn)選取的抗原稀釋度為1∶640，蛋白質(zhì)含量為0.241 mg/mL。酶標(biāo)二抗?jié)舛群凸ぷ鲿r(shí)間采用的是二抗說明書所推薦的。用確定好的最佳抗原和一抗結(jié)合濃度進(jìn)行臨界值測定最終確定0.30為臨界值，即檢測待檢樣品時(shí)，用重組蛋白建立的ELISA方法去檢測，若所測定的OD450≥0.30，則可判斷為陽性。

[1]薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社，2002：822-844.

[2]Brinkmann U，Mattes R E，Buckel P.Optimizing the expression in E.coli of a synthetic gene[J].Gene，1989，85（21）：109.

[3]汪家政，范 明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001：166-183.

[4]劉文波.A型魏氏梭菌類毒素疫苗與抗毒素的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，14（3）：13-16.

[5]王海林，高向陽.包涵體純化技術(shù)[J].生物技術(shù)通報(bào)，2007，14（1）：78-81.