盧保霞(綜述)，徐家麗(審校)

(1.蚌埠醫(yī)學院，安徽蚌埠 233004;2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院兒科，安徽 蚌埠 233004)

缺氧缺血性腦病是新生兒神經系統(tǒng)常見病，可致嚴重的神經系統(tǒng)后遺癥。我國缺氧缺血性腦病的發(fā)病率較高，而該病的治療尚無有效的方法。近年來，國內外大量實驗研究證實血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有神經保護作用，不同的用藥方法(如腦室輸注、靜脈推注、經鼻給藥、轉基因治療等)、用藥時間和藥物劑量使其產生神經保護作用的效果差異較大。

1 VEGF的結構及生物學活性

VEGF是Senger等［1］在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)的，能引起小靜脈對血液中大分子物質通透性改變。在血管內皮細胞上具有與VEGF高度特異性和親和力的受體，VEGF與其結合可引起胞質內鈣離子濃度短暫性升高，刺激三磷酸肌醇積聚，通過磷酸激酶特異性磷脂酶C完成自身磷酸化，促進血管內皮細胞分裂、遷移和增殖。缺氧時，VEGF可以維持內皮細胞正常結構，減少細胞凋亡的發(fā)生。

2 VEGF對缺氧缺血腦組織的保護作用

低氧作為一種信號刺激VEGF分泌并促進缺氧缺血腦組織VEGF高表達，進而促進血管內皮細胞增生，誘導大量新生血管形成，改善損傷腦組織血流供應，減輕腦損傷。同時，VEGF作為神經保護因子，減少缺血后神經細胞凋亡。

2.1 VEGF及其受體的高表達 VEGF的受體存在于血管內皮細胞、神經元、神經膠質細胞上。Gustavsson等［2］在SD大鼠缺氧預處理觀察血管反應的實驗中發(fā)現(xiàn)，無論是成年鼠還是幼鼠在缺氧合并缺血后，腦組織中VEGF及其受體表達均成倍增加。體外細胞缺氧培養(yǎng)時VEGF表達也上調，體外缺氧培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞及大鼠腦微血管內皮細胞，培養(yǎng)液中VEGF顯著上升，表達VEGF受體的間充質干細胞數也顯著上升。

2.2 VEGF的抗凋亡作用 腦對缺氧最敏感，缺氧時神經細胞受損，caspase-3被激活為有活性的酶，降解下游底物(如DNA修復酶、DNA依賴蛋白激酶、蛋白激酶C、Rb基因、DNA酶等)，使細胞凋亡事件完成且不可逆轉。VEGF可以抑制腦內caspase-3的活化，從而抑制神經細胞凋亡。缺氧在誘導VEGF產生的同時也可誘導血紅素加氧酶1的產生。VEGF與血紅素加氧酶1間存在著正反饋效應。后者參與血紅素的代謝，代謝產物包括CO、Fe2+和膽綠素等，其中Fe2+參與鐵蛋白的合成，而鐵蛋白和膽綠素是體內重要的抗氧化劑，對神經細胞起保護作用。VEGF可增加葡萄糖轉運蛋白1的基因表達，并使細胞內的葡萄糖轉運蛋白1轉移到細胞膜的能力增強，加強葡萄糖的腦內轉運，對抗缺氧缺血后腦內能量的衰竭而對抗凋亡。

2.3 對膠質細胞的作用 VEGF可促進培養(yǎng)的星形膠質細胞有絲分裂，刺激Schwann細胞增生和延長其成活時間。Wang等［3］在采用側腦室注入的方式給予大鼠大腦中動脈阻斷模型外源性VEGF的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF可刺激神經元、神經膠質細胞的生長、存活和軸突生長。

2.4 VEGF對神經發(fā)生的促進作用 Palmer等［4］在成年海馬神經的實驗研究中觀察到大腦再生的神經元主要在血管周圍，提示VEGF的促神經再生作用。Horie等［5］在研究不同氧氣濃度對小鼠神經干細胞體外增殖和分化實驗中證明缺氧可促進神經干細胞的增殖及分化，且與VEGF表達有關。缺氧導致神經膠質細胞VEGF的表達增加并誘導神經祖細胞遷移，VEGF表達上調與神經祖細胞遷移呈正相關。

3 VEGF治療缺氧缺血腦損傷的給藥方法

3.1 VEGF與血-腦脊液屏障 VEGF具有很強的增強微血管通透性的作用，特別是毛細血管后微靜脈和小靜脈。血-腦脊液屏障在大腦微環(huán)境的穩(wěn)定中起重要作用。缺氧可導致血-腦脊液屏障通透性增加，并直接與VEGF表達上調有關［6］。在缺血和有炎癥時VEGF可通過改變血-腦脊液屏障的緊密連接提高其通透性［7-8］。Kilic等［9］觀察到磷脂酰肌醇3激酶/Akt途徑介導VEGF在局灶性腦缺血后血-腦脊液屏障通透性發(fā)生改變，發(fā)現(xiàn)VEGF的神經保護作用常伴隨血-腦脊液屏障通透性的增加，這就限制了VEGF神經保護作用在臨床上的應用。如何發(fā)揮藥物的神經保護作用又減少血-腦脊液屏障通透性增加帶來的不良反應具有重要意義。

3.2 給藥途徑及劑量

3.2.1 給藥途徑 研究發(fā)現(xiàn)在缺氧缺血后一次性低劑量向腦室內輸注VEGF不僅可發(fā)揮VEGF的神經保護作用，還可避免其增加血管通透性，提示選擇適當的給藥方式可以避免不良反應。注入腦室給藥是有創(chuàng)操作，容易損傷大腦，導致顱內感染。Hayashi等［10］發(fā)現(xiàn)雄性Wistar大鼠局灶腦缺血后即靜脈注射重組人血管內皮生長因子(rhVEGF165)后，局灶腦缺血的半暗帶區(qū)血管生成增多，在缺血早期應用rhVEGF165增加了血-腦脊液屏障滲漏和出血傾向，加重了缺血損傷，結果提示，在急性期應用VEGF會增加出血轉化的風險，VEGF的半衰期很短，靜脈給藥需要持續(xù)給藥，而VEGF價格昂貴，臨床應用會給患者很大的經濟壓力。De Rosa等［11］在經鼻腔給予抗神經生長因子轉基因小鼠神經生長因子實驗研究中，觀察到一些大分子蛋白物質經鼻腔給藥后在嗅球高濃度聚集而血藥濃度并無明顯升高的現(xiàn)象，提示嗅黏膜與大腦之間存在一條繞過血-腦脊液屏障的直接通路。該通路的存在為VEGF提供了直接進入中樞神經的無創(chuàng)給藥途徑，也為中樞神經系統(tǒng)獲得顯著提高的藥物濃度和藥效提供了極大的方便。

3.2.2 給藥劑量 Yasuhara等［12］研究顯示，經大腦紋狀體途徑補充VEGF時對多巴胺能神經元有保護作用，1 μg/L VEGF的保護作用強于100 μg/L的保護作用，且高劑量VEGF還可導致腦水腫。此外，較大劑量的VEGF不僅可導致血-腦脊液屏障破壞，還可導致黑質多巴胺能神經元退變。楊冀萍等［13］發(fā)現(xiàn)在大鼠MCAO模型中經鼻給予VEGF 100 mg/L(300 μL)不能減少梗死體積，促進神經功能恢復，也不能誘導血管發(fā)生;而給予VEGF 200 mg/L(300 μL)既可以降低梗死體積，又可以促進神經功能修復以及誘導血管生成;但500 mg/L(300 μL)可以誘導血管生成，卻不能減少梗死體積和促進神經功能修復。因此，應使用合適劑量，在充分發(fā)揮VEGF神經保護功效的同時，避免帶來的負面影響，這一劑量還需實驗研究不斷探索。

3.3 VEGF的轉基因治療

3.3.1 基因載體 VEGF蛋白不僅難以透過血-腦脊液屏障而且半衰期很短，在循環(huán)中很快降解。轉基因治療法可以突破血-腦脊液屏障的限制，并產生穩(wěn)定的VEGF蛋白表達，產生長期穩(wěn)定的療效。關鍵是選擇基因載體，理想的載體應該具備如下特性:①較高的濃度(病毒數＞104/L);可以感染多種細胞。②方便制備并且能夠復制。③可以整合進入宿主的特定染色體位點或保持穩(wěn)定的游離基因。④具有與調控元件相應的轉錄單元。⑤能靶向感染目標細胞。⑥無免疫原性。腺病毒系統(tǒng)安全、遺傳毒性低、感染率高、易繁殖、宿主廣泛，其并不整合到宿主細胞，不會產生嚴重的不良反應［14-16］。Bellomo 等［17］分別構建了表達LacZ標示基因的重組腺病毒(rAAV-LacZ)和VEGF165cDNA的重組腺病毒(rAAV-VEGE165)載體，立體定向注射到沙土鼠左側腦室，6、12 d后將這些動物手術制做腦缺血/再灌注模型，分別評價腦水腫、CA1區(qū)的遲發(fā)性神經元死亡等指標，結果發(fā)現(xiàn)以rAAV-VEGE165處理的沙土鼠丘腦及皮質區(qū)免疫組化有明顯的VEGF陽性染色，沙土鼠在腦缺血/再灌注后24 h的生存率明顯高于rAAV-LacZ處理組，同時其腦組織含水量亦明顯減少，說明可顯著減輕腦梗死后的腦水腫程度，組織學觀察證實海馬CA1區(qū)的神經元死亡數量顯著少于rAAV-LacZ處理組。Zheng等［16］將腺病毒介導的VEGF165轉導至缺氧缺血性腦損傷7 d齡SD大鼠腦組織中，發(fā)現(xiàn)腺病毒介導的VEGF165能誘導腦組織的神經細胞和血管內皮細胞表達VEGF蛋白，其機制可能是通過調節(jié)抗凋亡基因及促凋亡基因表達有關的分子機制對缺氧缺血/再灌注后腦損傷發(fā)揮保護治療作用。腺病毒系統(tǒng)的缺點是免疫原性，基因表達時間短暫，基因容量小。慢病毒載體可感染各種細胞整合人基因組，持續(xù)表達，免疫原性低?；蛉萘啃?，有致基因突變的可能。納米顆粒作為載體性質穩(wěn)定，易于制備，可較長時間持續(xù)表達，無免疫原性，缺點是易受體內玻璃質等物理化學屏障影響［18］。

3.3.2 聯(lián)合其他基因治療 趙英杰等［19］在成年雄性Wistar大鼠腦缺血模型上聯(lián)合應用外源性VEGF165和促血管生成素1基因治療，發(fā)現(xiàn)外源性VEGF165和促血管生成素1基因合用可以保護腦細胞，促進新生血管生成，減輕腦水腫，改善大鼠腦神經功能。熱休克蛋白表達都有不同程度的上調及減輕缺血后的神經元損傷。已在腦缺血動物模型驗證了轉基因技術外源性過度表達熱休克蛋白的神經保護作用［20］。通過轉基因技術在缺血組織導入多種抗氧化酶基因雖可保護缺血缺氧后的神經元，但轉基因的安全性有待確定［21］。

3.4 給藥時間窗 缺氧缺血性腦病治療的“時間窗”一直是臨床醫(yī)師及科學研究者共同關心的問題。對于缺氧缺血性腦損傷后不同階段的認識有助于了解缺氧缺血性腦病治療的“時間窗”。缺氧缺血性損傷后組織細胞能量及代謝變化分為兩個階段:原發(fā)性細胞損傷階段和遲發(fā)性細胞損傷階段——繼發(fā)性能量衰竭。二次能量衰竭之間的潛伏期亦就是所謂的治療“時間窗”，是減輕腦損傷的神經保護措施能被成功應用的最佳時期。此間期在動物模型為6～15 h，在人類新生兒中可能更短(6 h左右)。

4 結語

目前，人們逐步認識到VEGF在缺氧缺血腦病中的重要作用。目前對VEGF的研究主要集中在嚙齒類動物模型上，VEGF對中樞神經系統(tǒng)的一切活性作用在動物模型上已經得到廣泛證實，臨床治療上尚缺乏更全面的臨床證據的支持。因此，VEGF真正能在新生兒缺血缺氧腦病中應用還存在用藥的安全劑量和安全有效的給藥方法等很多具體的問題。

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