孫 克(綜述)，王 威(審校)

(1.解放軍252醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定071000;2.保定市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定071000)

血小板是由巨核細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生的無核，但具有酶和生理活性的細(xì)胞，在生理性止血和某些病理過程中發(fā)揮著重要作用。近年來，臨床上需要輸注血小板的患者日益增多，但是輸注血小板價(jià)格高，且存在免疫學(xué)輸血反應(yīng)和感染的風(fēng)險(xiǎn)。為此，國際上一再降低血小板的輸注起點(diǎn)，由過去的20×109/L降至10×109/L，甚至5×109/L。鑒于此，臨床迫切需要檢驗(yàn)科提供一個(gè)準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果，但是準(zhǔn)確計(jì)數(shù)血小板并非易事［1］。現(xiàn)就目前臨床上最為常用的血小板計(jì)數(shù)方法［2-3］，即電阻抗法的原理、影響因素及對(duì)策進(jìn)行簡要綜述。

1 電阻抗法血小板計(jì)數(shù)原理

將等滲電解質(zhì)溶液稀釋的細(xì)胞懸液倒入不導(dǎo)電的容器中，將小孔管插入細(xì)胞懸液中，接通電流，小孔兩側(cè)產(chǎn)生穩(wěn)定的電流。懸液中的細(xì)胞通過小孔時(shí)，根據(jù)細(xì)胞非導(dǎo)電的性質(zhì)，會(huì)引起瞬間電壓的變化，產(chǎn)生一個(gè)脈沖信號(hào)。脈沖的振幅取決于細(xì)胞的體積，脈沖的數(shù)目取決于細(xì)胞的數(shù)目。血小板與紅細(xì)胞在同一系統(tǒng)進(jìn)行檢測，根據(jù)紅細(xì)胞與血小板體積差異，儀器設(shè)定閾值，高于閾值為紅細(xì)胞，低于閾值為血小板，由此得出血小板數(shù)目。為了使血小板計(jì)數(shù)更加準(zhǔn)確，不少公司又發(fā)明了一些專利計(jì)數(shù)。

1.1 擬合曲線 血細(xì)胞分析儀在進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)時(shí)只收集2～20 fl的原始數(shù)據(jù)，然后通過對(duì)數(shù)正態(tài)分布的擬合方法，計(jì)算出0～2 fl和20～70 fl的血小板數(shù)量。擬合曲線計(jì)數(shù)的使用，使血細(xì)胞分析儀在收集原始數(shù)據(jù)時(shí)，不收集0～2 fl的數(shù)據(jù)，可排除實(shí)驗(yàn)室信號(hào)噪聲的干擾，不收集20～70 fl的數(shù)據(jù)可排除小紅細(xì)胞和紅細(xì)胞碎片的干擾。

1.2 浮動(dòng)界標(biāo) 儀器測定血小板時(shí)，以細(xì)胞體積大小作為劃分血小板的依據(jù)。由于血小板與紅細(xì)胞在同一系統(tǒng)進(jìn)行檢測，為排除小紅細(xì)胞和大血小板的干擾，儀器使用浮動(dòng)界標(biāo)。浮動(dòng)界標(biāo)就是儀器使用上和下兩條辨別線或者上辨別線、固定辨別線和下辨別線;下辨別線的范圍一般在2～6 fl，上辨別線的范圍在20～35 fl，固定辨別線在12 fl。在計(jì)數(shù)血小板時(shí)，儀器自動(dòng)移動(dòng)上、下辨別線，以便有效檢查血小板計(jì)數(shù)。此方法可以很好地處理過多的小紅細(xì)胞和紅細(xì)胞碎片對(duì)血小板計(jì)數(shù)的干擾［4］。

2 血小板計(jì)數(shù)的影響因素

2.1 采血因素 采血因素是造成血小板計(jì)數(shù)結(jié)果偏低的主要因素，手指采血時(shí)如采血速度慢、出血不暢、擠壓采血部位等，都會(huì)造成假性血小板減少。靜脈采血時(shí)，多次穿刺會(huì)引起組織水腫及皮下出血，組織損傷造成血小板聚集、消耗，組織凝血因子混入血標(biāo)本，產(chǎn)生肉眼看不見的小凝塊，使血小板計(jì)數(shù)結(jié)果偏低［5］。同時(shí)有學(xué)者作過統(tǒng)計(jì)［6］，即使技術(shù)熟練者順利采集的血液標(biāo)本，靜脈血和末梢血的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果亦存在差異。國內(nèi)專家就血液分析儀血樣采集提出要求:除了嬰兒及少數(shù)無法取得靜脈血的患者外，其余患者均需采集靜脈血加抗凝劑，盡量避免用皮膚穿刺采取外周血［7］。

2.2 小紅細(xì)胞及巨大血小板的影響 使用電阻抗法進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，紅細(xì)胞和血小板在同一系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行檢測，正常情況下，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)細(xì)胞體積的識(shí)別有明顯的體積界限。但是，一些特殊標(biāo)本，如小紅細(xì)胞、細(xì)胞碎片、巨大血小板則會(huì)對(duì)血小板計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生干擾。對(duì)于紅細(xì)胞平均體積(mean corpuscular volum MCV)＜70 fl的血液標(biāo)本，盡管儀器具有浮動(dòng)界標(biāo)和擬合曲線的功能，一些大小近似血小板的小紅細(xì)胞，仍會(huì)被當(dāng)作血小板加以計(jì)數(shù)［8］。且MCV越小，小紅細(xì)胞數(shù)量越多，影響就越大。當(dāng)出現(xiàn)大血小板和巨大血小板時(shí)，儀器會(huì)將其計(jì)數(shù)為紅細(xì)胞，導(dǎo)致結(jié)果偏低［9］。

2.3 抗凝劑EDTA的影響 國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦，1.5～2.2 mg的乙二胺四乙酸二鉀鹽(ethylenediaminete traacetic acid K2，EDTA-K2)抗凝 1 mL的全血可以抑制血小板聚集，從而達(dá)到抗凝的目的。但是有少數(shù)人使用EDTA做抗凝劑時(shí)，卻會(huì)出現(xiàn)血小板聚集的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致血液分析儀不能正常計(jì)數(shù)［10］，稱為EDTA依賴的血小板假性減少癥。其發(fā)生機(jī)制尚不明確，可能與纖維蛋白受體和糖蛋白有關(guān)［11］。多伴發(fā)于某種嚴(yán)重疾病，如膿毒血癥、癌癥、自身免疫性疾病、傳染性單核細(xì)胞增多癥等，也可見于一些門診健康體檢者和剛出生的嬰幼兒。另外，血液和抗凝劑比例也會(huì)影響檢測質(zhì)量。血液比例過高時(shí)，由于抗凝劑相對(duì)不足，血漿中出現(xiàn)微血塊的可能性增加從而導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏低?？鼓齽┑臐舛仍龈撸“鍟?huì)腫脹、崩解，產(chǎn)生正常血小板大小的碎片從而無法得出正確的結(jié)果。

2.4 其他因素 在實(shí)際工作中，標(biāo)本放置時(shí)間［12］、試劑質(zhì)量［13］、血小板冷凝集以及異常蛋白血癥等都可影響血小板的正常計(jì)數(shù)。

3 對(duì)策

3.1 重視血小板直方圖的觀察 電阻抗法血液分析儀在進(jìn)行血液分析時(shí)，除給出細(xì)胞數(shù)外，還給出細(xì)胞體積分布的直方圖。血小板直方圖作為分析后質(zhì)量控制的重要步驟，可以反映血小板計(jì)數(shù)的干擾因素。

3.1.1 正常的血小板直方圖 血細(xì)胞分析儀通常檢測血小板體積分布在2～30 fl范圍內(nèi)的血小板，直方圖上正常血小板主要集中在2～20 fl，呈左偏態(tài)分布。在20～30 fl(隨儀器型號(hào)而定)直方圖曲線逐漸接近橫坐標(biāo)或與之重合［14］。

3.1.2 大血小板增多的血小板直方圖 與正常的血小板直方圖相比，曲線峰右側(cè)右移，特別是與橫坐標(biāo)接近點(diǎn)或重合點(diǎn)明顯右移，同時(shí)血小板平均體積增高，一般＞12 fl，在白細(xì)胞直方圖35 fl處，?？梢娨粋€(gè)小高峰［14］。同時(shí)，MCV和紅細(xì)胞分布寬度正常，可以排除小紅細(xì)胞的干擾。

3.1.3 血小板聚集干擾的血小板直方圖 與正常的血小板直方圖相比，曲線分布峰明顯右移且左側(cè)起點(diǎn)較高，不與橫坐標(biāo)重合，MPV值增高，血小板計(jì)數(shù)值通常明顯減低，儀器一般不顯示血小板其他參數(shù)［15］。

3.1.4 小紅細(xì)胞或紅細(xì)胞碎片干擾的血小板立方圖 與正常的血小板直方圖相比，直方圖曲線光滑，峰高位置均正常，右側(cè)尾部接近橫坐標(biāo)但未與橫坐標(biāo)重合，而是與橫坐標(biāo)平行延伸后抬高，欲形成另外一個(gè)峰［16］。抬高起始位置＞25 fl。同時(shí)紅細(xì)胞直方圖波峰明顯左移，起始部位抬高，MCV通常＜70 fl，血小板計(jì)數(shù)值假性升高［17］。

3.2 光學(xué)法進(jìn)行復(fù)檢 使用電阻抗法進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，對(duì)于正常血液標(biāo)本來說，具有經(jīng)濟(jì)、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。由于其方法學(xué)的局限性，當(dāng)出現(xiàn)血小板直方圖的異常時(shí)，必須使用其他方法進(jìn)行復(fù)檢。光學(xué)法采用的是半導(dǎo)體流式細(xì)胞檢測原理，對(duì)每個(gè)血小板從高低角度二維激光掃描，即用前向散射光檢測血小板體積，由熒光強(qiáng)度提供RNA信息進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)的確認(rèn)和計(jì)數(shù)［18］。目前，多數(shù)學(xué)者［19-21］認(rèn)為，當(dāng)血液標(biāo)本中存在大血小板、血小板凝集、紅細(xì)胞或紅細(xì)胞碎片以及低值血小板時(shí)，使用光學(xué)法進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)可以獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

3.3 手工法復(fù)檢 對(duì)于血小板直方圖異常的血液標(biāo)本，可以令有經(jīng)驗(yàn)的工作人員使用國際衛(wèi)生組織推薦的草酸銨法進(jìn)行目視顯微鏡計(jì)數(shù)。但是該法計(jì)數(shù)血小板較少，重復(fù)性差。有學(xué)者報(bào)道，該法在不同操作者間的變異系數(shù)可達(dá)10%～25%。劉善鳳等［22］通過制備血涂片在油鏡觀察，不僅能發(fā)現(xiàn)血涂片中血小板的數(shù)量分布情況，還能觀察血小板和紅細(xì)胞是否存在形態(tài)學(xué)病理改變，并通過計(jì)數(shù)白細(xì)胞和血小板的比值間接計(jì)數(shù)血小板的數(shù)量。對(duì)電阻抗法血小板計(jì)數(shù)，可以起到很好的補(bǔ)充作用，對(duì)及早發(fā)現(xiàn)和初步糾正血小板假性減低有明顯意義。具體方法［23］如下:在血片體尾交界區(qū)，采用城垛式計(jì)數(shù)方法無重復(fù)計(jì)數(shù)100個(gè)血小板(N目測血小板數(shù))和涉及視野中所有的白細(xì)胞數(shù)(N目測白細(xì)胞數(shù))，對(duì)于血小板嚴(yán)重減少的患者，計(jì)數(shù)不少于50個(gè)血小板;以儀器計(jì)數(shù)的白細(xì)胞數(shù)(N儀器×109)作為參考，血小板數(shù)量 N=(N目測血小板數(shù)/N目測白細(xì)胞數(shù))N儀器×109/L。

綜上所述，隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，電阻抗法的血液分析儀已廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)工作中，極大地提高了檢驗(yàn)人員的工作效率和工作質(zhì)量。由于其方法學(xué)的局限性，易受到各種干擾因素的影響，所以熟知其工作原理及各種影響因素，并能夠通過血小板直方圖及其相關(guān)參數(shù)判斷干擾因素的形成原因?qū)τ谘“逵?jì)數(shù)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。對(duì)異常的血液標(biāo)本宜通過光學(xué)法或手工法進(jìn)行糾正，以保證為臨床診斷、治療工作提供可靠的信息資料。

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