周華妙 郭 勇 浙江省中醫(yī)院 杭州 310006

結(jié)直腸癌的發(fā)病涉及多種因素及步驟，而腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移更是提高結(jié)直腸癌臨床療效和生存期的主要障礙，很多結(jié)直腸癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，所以控制轉(zhuǎn)移成為決定癌癥患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。中醫(yī)認(rèn)為，“毒、虛、瘀”是腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的主要病因，而血瘀證是惡性腫瘤患者的主要證候之一，臨床腫瘤轉(zhuǎn)移患者多見不同程度的血瘀癥狀。孫秉嚴(yán)將臨床各種腫瘤分為八證，其中寒瘀毒結(jié)最為多見，占腫瘤患者80%以上［1］。由此認(rèn)為，除毒、虛、瘀外，“寒”是腫瘤晚期患者的又一病理特點(diǎn)，“血瘀”、“寒凝”與毒邪膠結(jié)不解，既加重病情，又促使轉(zhuǎn)移。然而一直以來，對腫瘤晚期患者出現(xiàn)的血瘀證是否應(yīng)用活血化瘀療法存在爭議。有人認(rèn)為，血瘀證是腫瘤晚期患者為了抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的一種保護(hù)機(jī)制，活血化瘀能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，加速疾病進(jìn)展?；谏鲜霰尘埃覀兏鶕?jù)中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動物模型方法學(xué)，建立寒凝血瘀證C26結(jié)腸癌小鼠人工血行肺轉(zhuǎn)移模型，觀察其肺組織VEGF、MMP-2表達(dá)，探討寒凝血瘀對結(jié)直腸癌及其轉(zhuǎn)移的影響，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雌性8周齡Balb/c小鼠24只（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供），SPF條件下飼養(yǎng)：溫度24±2℃，濕度55±5%，噪音＜50db，每12h 1次亮暗循環(huán)，2周更換1次敷料，用無菌營養(yǎng)顆粒飼料飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)瘤株 小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞colon-26（C26），購自上海細(xì)胞庫。

1.3 藥物及試劑 生理鹽水（常州康普藥業(yè)有限公司，批號0905025）；0.1%鹽酸腎上腺素（天津金耀氨基酸有限公司，批號H12020526）。Marker（Ferment公司），脫脂奶粉（光明乳液股份有限公司），化學(xué)發(fā)光試劑A、B（Millipore Corparation公司），羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（Santa Cruz公司），MMP-2一抗、VEGF一抗（Abcom 公司），胎牛血清（Hyclone公司），顯影液、定影液及膠片（Kodak公司），蛋白定量試劑盒A、B（Bio-rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分 組 應(yīng)用計(jì)算機(jī)生成的隨機(jī)數(shù)字表將24只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、寒凝血瘀組、單純荷瘤組和復(fù)合造模組，每組6只。

2.2 造 模 參照文獻(xiàn)［2］方法，空白對照組小鼠每天定點(diǎn)皮下注射生理鹽水0.1mL，1h后進(jìn)行1次常溫水浴4min，水浴后1h再次皮下注射生理鹽水0.1mL，連續(xù)4周，后2周隔天進(jìn)行，第15天經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水0.1mL。寒凝血瘀組小鼠每天定點(diǎn)皮下注射0.1%腎上腺素0.08mL/kg（用生理鹽水稀釋至0.2mL），分2次注射，第一次注射后1h，進(jìn)行冰浴（4℃～6℃）4min，1h后再行第二次注射，連續(xù)4周，后2周隔天進(jìn)行，第15天經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水0.1mL。單純荷瘤組小鼠每天定點(diǎn)皮下注射生理鹽水0.1mL，1h后進(jìn)行1次常溫水浴4min，水浴后1h再次皮下注射生理鹽水0.1mL，連續(xù)4周，后2周隔天進(jìn)行，第15天經(jīng)尾靜脈注射C26單細(xì)胞懸液（密度=4×106）0.1mL。復(fù)合造模組小鼠每天定點(diǎn)皮下注射0.1%腎上腺素0.08mL/kg（用生理鹽水稀釋至0.2mL），分2次注射，第一次注射后1h，進(jìn)行冰?。?℃～6℃）4min，1h后再行第二次注射，連續(xù)4周，后2周隔天進(jìn)行，第15天經(jīng)尾靜脈注射C26單細(xì)胞懸液（密度=4×106）0.1mL。

2.3 標(biāo)本采集及檢測 于造模第28天采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，超凈臺上解剖小鼠，取出全部肺組織，固定于10%福爾馬林，常規(guī)包埋、石蠟切片，留取部分左肺組織采用免疫組化SP法檢測VEGF；將另一部分左肺組織剪碎、碾磨、裂解、離心，取上清液，采用Western Blot檢測MMP-2蛋白濃度。多余標(biāo)本分裝標(biāo)記后凍存于-80℃冰箱中備用。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，采用秩和檢驗(yàn)、方差分析、χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠肺組織VEGF表達(dá) 單純荷瘤組、復(fù)合造模組小鼠結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移灶VEGF表達(dá)上調(diào)，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；復(fù)合造模組VEGF表達(dá)率高于寒凝血瘀組和單純荷瘤組，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組VEGF表達(dá)率比較

3.2 各組小鼠肺組織MMP-2蛋白含量 單純荷瘤組、復(fù)合造模組MMP-2表達(dá)均明顯升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；寒凝血瘀組MMP-2表達(dá)低于復(fù)合造模組和單純荷瘤組（P＜0.01）；復(fù)合造模組MMP-2表達(dá)高于單純荷瘤組（P＜0.05）；寒凝血瘀組MMP-2表達(dá)雖低于空白對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組MMP-2蛋白含量比較（±s） ng/mL

表2 各組MMP-2蛋白含量比較（±s） ng/mL

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與單純荷瘤組、復(fù)合造模組比較，△P＜0.01；與復(fù)合造模組比較，▲P＜0.05

6 6 6 6 0.76±0.11 0.69±0.10△1.46±0.14**▲1.65±0.15**空白對照組寒凝血瘀組單純荷瘤組復(fù)合造模組

4 討 論

新生血管在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）直接促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，是腫瘤血管新生的主要促生長因子。VEGF與其特異性受體結(jié)合后，引起受體二聚化，胞內(nèi)激酶區(qū)構(gòu)象改變，產(chǎn)生激酶活性催化底物蛋白磷酸化，最終通過信號傳導(dǎo)分子的級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生一系列生物效應(yīng)。在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞、侵入腫瘤的巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)血管形成，促進(jìn)腫瘤持續(xù)生長，并提高血管通透性，引起周圍組織纖維蛋白沉著，促進(jìn)單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞浸潤，有利于腫瘤基質(zhì)形成和腫瘤細(xì)胞進(jìn)入新生血管，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。VEGF已成為監(jiān)測多種腫瘤復(fù)發(fā)或患者生存率的重要指標(biāo)，是一個(gè)很有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物［3-4］。Zucker等［5］發(fā)現(xiàn)腫瘤血管形成早期VEGF可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，使凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶，從而激活明膠酶原A降解原來的基膜，使細(xì)胞增殖。孫志勇等［6］研究發(fā)現(xiàn)腸癌患者手術(shù)治療前血清VEGF顯著高于手術(shù)后，且術(shù)后復(fù)發(fā)患者血清VEGF明顯高于未復(fù)發(fā)者，表明血清VEGF參與了腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為［7-8］，缺氧是調(diào)節(jié)VEGF的主要因素之一。研究［9］認(rèn)為，缺氧可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩個(gè)水平上調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)新生血管的生成，加速腫瘤轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合造模組和單純腫瘤組小鼠結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移灶的VEGF表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；復(fù)合造模組VEGF陽性表達(dá)率與單純腫瘤組比較雖有上調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示在寒凝血瘀狀態(tài)下，血液在血管內(nèi)失去了“如水之流”的狀態(tài)，黏滯度增高，微循環(huán)障礙，血流變慢，加重了腫瘤組織的缺血缺氧，進(jìn)一步促使腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤組織中新生血管形成，加快了結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。表明VEGF可能是促進(jìn)結(jié)腸癌人工肺轉(zhuǎn)移中微血管生成的主要因子之一。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類具有降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜能力的蛋白水解酶，是人體內(nèi)降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，在腫瘤細(xì)胞突破基底膜屏障而浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用。當(dāng)細(xì)胞惡變時(shí)常有MMPs的升高，它們能降解基底膜的骨架成分即各類膠原及蛋白。MMP-2是該蛋白酶家族中主要成員之一，能降解明膠酶和Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ型膠原蛋白，所以又稱明膠酶或Ⅳ型膠原酶。研究表明［10-13］，在許多腫瘤組織中，都發(fā)現(xiàn)有較高M(jìn)MP-2表達(dá)，并且其表達(dá)程度與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。王康等［14］研究發(fā)現(xiàn)，MMP2陽性表達(dá)強(qiáng)度及表達(dá)陽性率按正常大腸黏膜組織、遠(yuǎn)癌旁黏膜組織、近癌旁黏膜組織及大腸癌組織的順序依次增高，認(rèn)為其過度表達(dá)可促進(jìn)大腸癌的惡性發(fā)展，且其程度與表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單純腫瘤組和復(fù)合造模組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶MMP-2表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；復(fù)合造模組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶MMP-2表達(dá)較單純腫瘤組小鼠為高（P＜0.05），說明結(jié)腸腺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移時(shí)MMP-2表達(dá)明顯增強(qiáng)，而在寒凝血瘀狀態(tài)下其表達(dá)更高，這可能與寒凝血瘀狀態(tài)下腫瘤組織缺血缺氧更嚴(yán)重，刺激VEGF和MMP-2表達(dá)上調(diào)有關(guān)。說明在寒凝血瘀狀態(tài)下，MMP-2蛋白高表達(dá)，可能促進(jìn)結(jié)腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

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