武聳荔 趙彥程 李 紅 楊雪艷 王紅艷 陳 瑛

神經(jīng)管畸形(NTDs)是一種由于胚胎發(fā)育早期因神經(jīng)管不閉合或閉合不完全所造成的常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)出生缺陷［1］，由遺傳和環(huán)境因素共同作用［2～4］。目前國(guó)內(nèi)外多集中于與神經(jīng)管發(fā)育相關(guān)基因的突變研究［5～8］，隨著首次在NTDs 患者中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)VANGL1 基因特有的雜合性錯(cuò)義突變［5］，隨后篩查發(fā)現(xiàn)了FUZZY 基因在3 例NTDs 患者中特有的雜合性錯(cuò)義突變［8］，這些研究均提供了人類神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因突變可能會(huì)導(dǎo)致NTDs 發(fā)生的證據(jù)。

ZIC2 是ZIC 鋅指家族5 個(gè)成員之一。ZIC 家族基因編碼鋅指轉(zhuǎn)移因子，其結(jié)構(gòu)上包含進(jìn)化上高度保守的5 個(gè)串聯(lián)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)［9］。ZIC2 編碼的轉(zhuǎn)移因子在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中起著極其重要的作用，參與神經(jīng)管和神經(jīng)嵴的形成［10］。小鼠Zic2 基因敲除或Zic2 表達(dá)量下降會(huì)導(dǎo)致NTDs 產(chǎn)生，表型為前腦裂畸形和脊柱裂［11］。在人群中，ZIC2 雜合基因突變，即13q32 區(qū)域雜合性缺失會(huì)導(dǎo)致前腦裂畸形［12］。由于ZIC2 進(jìn)化上保守，同時(shí)在小鼠神經(jīng)管閉合中起著重要作用，而小鼠神經(jīng)管發(fā)生的機(jī)制與人類極為相似，因此ZIC2 基因突變可能會(huì)引發(fā)人類NTDs。有系列研究在人類NTDs 患者中進(jìn)行了ZIC2 基因突變篩查，但并未發(fā)現(xiàn)任何致病性基因突變或與NTDs 相關(guān)的SNP［13～15］。然而上述結(jié)果均來(lái)自對(duì)歐美人群的篩查，迄今缺乏中國(guó)NTDs 人群的篩查結(jié)果。另一方面，既往報(bào)道大多以脊柱裂存活患者為研究對(duì)象，但若ZIC2 基因?yàn)橹滤佬酝蛔?，則攜帶該突變的個(gè)體就難以發(fā)育至成熟?；谝陨峡紤]，本研究在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上，征集因嚴(yán)重NTDs 死亡或流產(chǎn)的中國(guó)人群胎兒DNA 樣本，對(duì)ZIC2 外顯子進(jìn)行突變篩查。

1 方法

1.1 NTDs 樣本來(lái)源 與文獻(xiàn)［6］的樣本相同，由2 部分組成:①山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院和山西長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院提供的NTDs 胎兒臍帶血抽提的DNA 樣本142 份;②江蘇省蘇州市立醫(yī)院母子健康研究中心提供的NTDs 胎兒臍帶血樣本21 份。所有樣本均經(jīng)孕期B 超確診，部分樣本同時(shí)經(jīng)病理學(xué)解剖證實(shí)為NTDs。均為有明顯NTDs 癥狀同時(shí)不伴有其他重大出生缺陷(如先天性心臟病)的胎兒。

1.2 對(duì)照樣本來(lái)源 由3 部分組成:①山西醫(yī)科大學(xué)和山西長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院提供的正常生產(chǎn)健康胎兒臍帶血樣本96 份和健康成年婦女血樣192 份;②山西長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院提供的健康成年男性血樣192 份;③江蘇省蘇州市立醫(yī)院提供的健康成年人血樣96 份。所有對(duì)照樣本由醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)體檢，確認(rèn)無(wú)NTDs、先天性心臟病、智力低下、精神分裂癥、糖尿病、高血壓和癌癥等出生缺陷和重大疾病。

1.3 倫理學(xué) 本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，胎兒由其父母簽署知情同意書(shū)，成人由其本人簽署知情同意書(shū)后進(jìn)入本研究。

1.4 ZIC2 基因突變篩查

1.4.1 DNA 提取 使用傳統(tǒng)酚-氯仿法抽提DNA。蛋白酶K 購(gòu)自Sigma 公司，乙醇、酚、氯仿、異戊醇、碳酸氫鈉等試劑均為上海試劑廠產(chǎn)品;抽提出的DNA 采用Thermo Scientific 公司的Nanodrop 2000 分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度。

1.4.2 PCR 擴(kuò)增 針對(duì)外顯子設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物，從基因組上擴(kuò)增外顯子序列，引物序列見(jiàn)表1，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR 使用TAKARA 公司產(chǎn)品，包括HSTaq 酶、反應(yīng)緩沖液、dNTP，以及提供的相應(yīng)體系和擴(kuò)增條件。ZIC2 Exon3 序列GC 含量較高，采用LATaq 酶(TAKARA 公司)擴(kuò)增。

1.4.3 ZIC2 外顯子區(qū)域的突變篩查 取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。采用美國(guó)ABI 公司的Bigdye 試劑盒和3730 遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果采用Seqman 軟件分析。測(cè)序發(fā)現(xiàn)的突變進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證，并對(duì)NTDs 組中發(fā)現(xiàn)的突變?cè)趯?duì)照組中測(cè)序，驗(yàn)證是否為NTDs 特有的突變。

表1 ZIC2 基因編碼區(qū)PCR 擴(kuò)增引物序列Tab 1 Primers for amplification of ZIC2 coding region

2 結(jié)果

通過(guò)對(duì)NTDs 163 份胎兒DNAs 標(biāo)本進(jìn)行ZIC2 編碼區(qū)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)一個(gè)同義突變c.1140G ＞A(圖1)，未發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變或重復(fù)缺失。同義突變c.1140G ＞A 位于第2 外顯子(圖2)，為1 例妊娠期37 周診斷為枕部腦膜腦膨出的女性胎兒。KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)分析ZIC2 結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)該同義突變位于ZIC2 的一個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)中，該同義突變?cè)趯?duì)照組中進(jìn)行基因分型未檢測(cè)到相同突變。

圖1 NTDs 病例中發(fā)現(xiàn)的同義突變c.1140G ＞A 測(cè)序圖Fig 1 Sequencing result highlighting the mutation c.1140G＞A in case

圖2 NTDs 病例中發(fā)現(xiàn)的突變?cè)赯IC2 中位置Fig 2 Location of ZIC2 rare mutation identified in NTDs cases

3 討論

ZIC2 位于染色體13q32，其氨基酸序列高度保守。ZIC家族參與哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)生時(shí)期一系列發(fā)育過(guò)程，包括早期神經(jīng)格局、神經(jīng)嵴發(fā)育、小腦發(fā)育和左右對(duì)稱等［10］。在早期發(fā)育期ZIC 家族基因功能有重疊，但不同基因突變產(chǎn)生不同表型［11］。已有大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明ZIC2 參與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，ZIC2 基因敲除會(huì)出現(xiàn)NTDs 表型［12，16，17］。小鼠和人中發(fā)現(xiàn)Zic2 突變會(huì)造成前腦裂畸形、脊柱裂、神經(jīng)形成延遲和神經(jīng)嵴發(fā)育延遲［13］。Zic2 純合突變小鼠胚胎缺失背外側(cè)鉸鏈點(diǎn)(DLHP)不能形成閉合神經(jīng)管最終導(dǎo)致嚴(yán)重的脊柱裂，尤其是脊柱后端［16］。人類中也發(fā)現(xiàn)ZIC2 雜合基因突變，即13q32 區(qū)域雜合性缺失會(huì)導(dǎo)致前腦裂畸形［12］。目前在西方人群中完成的針對(duì)ZIC2 基因突變與NTDs 的相關(guān)性研究中，并未在ZIC2 中發(fā)現(xiàn)NTDs 患者特有的可以改變氨基酸序列的罕見(jiàn)基因突變［13，14］。Brown等［14］在173 例有西班牙裔種族背景的NTDs 患者中進(jìn)行ZIC2 突變篩查，其中95%病例患有腰骶脊柱裂，5%病例患有腦膨出或其他類型NTDs，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致讀碼框改變的突變，卻發(fā)現(xiàn)第1 外顯子中存在CAC 重復(fù)多態(tài)(c.718－720dupCAC)與NTDs 發(fā)生相關(guān)。但后續(xù)針對(duì)該位點(diǎn)在西班牙人群和南美人群中的深入研究結(jié)果并不支持該多態(tài)性位點(diǎn)與NTDs 發(fā)生相關(guān)［15，18］。此外在來(lái)自荷蘭的NTDs 人群研究中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性位點(diǎn)的存在，但該項(xiàng)研究在1 例男性脊柱裂患者ZIC2 第1 外顯子發(fā)現(xiàn)1 個(gè)丙氨酸密碼子缺失(c.94－96delGCG)，該突變遺傳自患者未患病的母親和外祖母［13］。

本研究NTDs 樣本均為因嚴(yán)重NTDs 而流產(chǎn)的胎兒，研究發(fā)現(xiàn)與既往歐洲人群樣本的研究結(jié)果一致，并未在ZIC2中發(fā)現(xiàn)NTDs 患者特有的可以改變氨基酸序列的罕見(jiàn)基因突變，同時(shí)也未檢測(cè)到c.718－720dupCAC 多態(tài)性位點(diǎn)和c.94－96delGCG 突變位點(diǎn)，進(jìn)一步說(shuō)明了ZIC2 蛋白序列的保守性和功能重要性。在NTDs 人群中發(fā)現(xiàn)的眾多專屬罕見(jiàn)突變及其功能研究表明這些罕見(jiàn)突變可能是造成NTDs 的原因［5～8］。本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)位于C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的精氨酸同義突變，由于沒(méi)有父母樣本不能判斷是否為新發(fā)突變，但在正常對(duì)照組中測(cè)序結(jié)果顯示該同義突變是NTDs特異性的突變位點(diǎn)。雖然同義突變不會(huì)改變氨基酸序列，但是可能會(huì)影響ZIC2 蛋白正常生理功能的行使，甚至對(duì)其翻譯效率造成影響，因此該位點(diǎn)潛在的功能效應(yīng)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究是首次在中國(guó)人群中進(jìn)行與NTDs 相關(guān)的ZIC2基因突變篩查，與既往歐美人群中篩查ZIC2 基因突變研究不同的是，本研究采用的病例DNA 樣本來(lái)自極端嚴(yán)重NTDs 的流產(chǎn)胎兒，旨在找到可能與NTDs 發(fā)生關(guān)系更密切、致病效力更強(qiáng)的致命性突變。與來(lái)自其他人群的研究結(jié)果類似，本研究在嚴(yán)重NTDs 病例中并未找到ZIC2 基因錯(cuò)義突變。

綜上所述，來(lái)自不同種族NTDs 人群的研究結(jié)果表明ZIC2 基因未檢測(cè)到編碼區(qū)錯(cuò)義突變?？紤]到小鼠中Zic2基因敲除或者突變導(dǎo)致的各種NTDs 表型，推測(cè)有可能ZIC2 基因錯(cuò)義突變將導(dǎo)致更早期的人體胚胎發(fā)育障礙，可能是早期胚胎自然流產(chǎn)的原因之一;因此在發(fā)育后期(孕15 周后)或者NTDs 存活患兒中檢測(cè)不到ZIC2 突變。只有在NTDs 病例中確認(rèn)ZIC2 基因的啟動(dòng)子、內(nèi)含子、3'UTR甚至基因拷貝數(shù)有無(wú)變異后，才能夠全面確認(rèn)ZIC2 基因與人群NTDs 發(fā)生的關(guān)聯(lián)關(guān)系。

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