劉亞旻，宋 波，李宗陽，姜保平，潘瑞樂

中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院藥用植研究所 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京100193

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以嚴重的認知和記憶功能減退為臨床表現的神經退行性病變［1，2］。其發(fā)病機制復雜，尚不完全清楚。目前，被廣為接受的病理學說為“膽堿能缺失學說”，其學說認為乙酰膽堿的缺失導致AD 患者認知功能下降，記憶能力喪失［3］。而膽堿酯酶(ChE)是生物神經傳導中的一種非常重要的酶，膽堿酯酶會催化乙酰膽堿的裂解反應，導致乙酰膽堿的缺失、神經信號傳遞失敗。膽堿酯酶根據其催化底物的特異性分為乙酰膽堿酯酶(AChE)和丁酰膽堿酯酶(BuChE)。故目前對老年癡呆的藥物治療主要是通過抑制ChE 來提高患者體內的乙酰膽堿水平［4，5］。但是傳統的選擇性AchE 抑制劑，不但外周副作用較大，且長期用藥效果不理想，而選擇性BuchE 抑制劑可使細胞外乙酰膽堿濃度增加15 倍，且未發(fā)現膽堿樣副作用［6-8］。因此，尋找AChE 和BuChE 雙重抑制劑為治療AD 提供了新的思路。本課題組前期運用薄層色譜生物自顯影和微孔高通量篩選方法，對40 種抗老年癡呆有潛在作用的中藥進行了篩選，結果篩選出11 種具有膽堿酯酶雙重抑制作用的中藥，其中前胡(Radix Peucedani )是作用較強的中藥之一，總ChE 抑制率＞50%。應用水蒸氣蒸餾法將前胡分為揮發(fā)油和水提物兩個部位，對兩個部位的膽堿酯酶抑制活性進行篩選，結果表明揮發(fā)油具有較好的抑酶作用，而水提物部位作用較弱。本研究對前胡揮發(fā)油AChE 和BuChE 的體外抑制作用進行了研究，并運用GC-MS 結合Kovats 指數對揮發(fā)油成分進行了結構鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備

美國GC (Varian 431-GC Gas Chromatograph，VF-5 布魯克)/MS(Varian 300-MS TQ Mass Spectrometer)儀;GC-MS Solution 色譜工作站;NIST 05 標準質譜圖庫;DB-5 毛細管石英柱(0.32 mm ×30 m，0.25 μm，Agilent 公司);揮發(fā)油提取器，圓底燒瓶(1000 mL)，冷凝管，燒杯(華西醫(yī)科大學儀器廠);5 L 恒熱電熱套(上海中興儀器有限公司);電子天平(上海天平儀器廠);恒溫水浴鍋(GB11240-89 型號GSY-II 型 北京醫(yī)療);低溫高速離心機(Thermo 德國);微孔板掃描酶標儀(BioTek 美國);SSW 型微電腦電熱恒水槽(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)。

1.1.2 藥材與試劑

前胡飲片(購于祥威中藥飲片廠，符合《中國藥典》及《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》，且由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定拉丁學名);正構烷烴參考系C8-C40(美國Chem Service 公司);去離子水;高純氮;實驗小鼠(購自北京軍事醫(yī)學科學院動物中心，均為健康雄性小鼠，體重20～24 g，【SCXK(軍)2007-004】);碘化硫代乙酰膽堿(A5751，純度≥98%)、氯化丁酰膽堿(B2753，純度≥98%)、5，5’-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB，D8130，純度≥98%)、酶終止劑-十二烷基硫酸鈉(SDS，純度＞95%)、他克林(A3773，純度＞99%)、四異丙基甲基焦磷酰胺(ISO-OMPA，T1505，純度＞99%)，均購自SIGMA 公司;PBS 磷酸緩沖鹽溶液(索萊寶生物科技公司);96 孔板(Costar 3599 美國);二甲基亞砜(DMSO)、乙醇、環(huán)己烷等化學試劑為分析純(北京化工廠)。

1.2 方法與結果

1.2.1 試液的制備

1.2.1.1 供試液的制備

取上述前胡中藥飲片粉碎，過40 目篩，稱取200 g，加10 倍量水浸泡過夜后，用揮發(fā)油提取器按《中國藥典》附錄之揮發(fā)油測定法甲法項下測定，蒸餾至揮發(fā)油量不再增加，放置1h 后讀取揮發(fā)油量為2.1 mL，并計算提取率，經無水硫酸鈉干燥即得。前胡揮發(fā)油為橙黃色油狀物，具有特殊香味。取前胡揮發(fā)油0.1 mL，以環(huán)己烷稀釋100 倍作供試品備用，即濃度為1 μL/mL。

前胡揮發(fā)油的提取率(%)=前胡中揮發(fā)油含量/前胡重量×100% =1.05%

1.2.1.2 底物的配制

分別取7.2 mg 碘化硫代乙酰膽堿和氯化丁酰膽堿，分別用PBS 溶液定容于2 個5 mL 的棕色容量瓶中，低溫保存，使用時每毫升用PBS 溶液稀釋40 倍。

1.2.1.3 顯色劑的配制

取25 mgDTNB 用PBS 溶液定容于25 mL 棕色容量瓶中，用時現配，避光保存。

1.2.1.4 酶終止劑的配制

取酶終止劑-十二烷基硫酸鈉3 g 溶解于100 mL PBS 溶液。

1.2.2 酶液的制備與活力的測定［9，10］

酶液源于小鼠(C57 品系正常小鼠，購自北京軍事醫(yī)學科學院動物中心，【SCXK(軍)2007-004】)的肝臟。將小鼠斷頸猝死，取其肝臟1 g 于玻璃勻漿器中，按1∶9(W/V)加入冰冷的PBS 磷酸鹽緩沖液(PH=7.4)，研成勻漿狀，移入離心管中4 ℃離心30 min(3000 轉/min)，吸取上清液貯于-20 ℃冰箱中備用。使用前加入冰冷的PBS 磷酸鹽緩沖液(PH=7.4)稀釋至約10 mL.酶活力的測定見參考文獻［10］。

1.2.3 前胡揮發(fā)油的膽堿酯酶抑制作用

1.2.3.1 乙酰膽堿酯酶抑制活性

采用改良的Ellman［11］方法:實驗設空白組，溶劑對照組，樣品組及陽性對照組，反應體系中各加入32 μL 酶液、160 μL(濃度為1 μL /mL)樣品抑制劑(溶劑對照組抑制劑為1‰DMSO，陽性對照組抑制劑為濃度1 mg/mL 陽性藥他克林)和400 μL 顯色劑DTNB(空白組在加完DTNB 后加入400 μL SDS終止反應)，補水至1.2 mL，37 ℃孵育5 min，加入底物400 μL 碘化硫代乙酰膽堿37 ℃孵育15 min，再加入400 μL SDS 終止反應，用酶標儀在波長為412 nm 處測定吸光度值，計算乙酰膽堿酯酶抑制率，乙酰膽堿酯酶抑制率(%)={1-(A 樣本-A 空白)/(A 對照-A 空白)}×100%。實驗重復三次，結果見表1。

1.2.3.2 丁酰膽堿酯酶抑制活性

采用改良的Ellman［11］方法，具體操作方法與乙酰膽堿酯酶抑制活性測定相同，將其底物碘化硫代乙酰膽堿換成氯化丁酰膽堿即可，其中陽性對照組抑制劑為濃度1 mg/mL 陽性藥四異丙基甲基焦磷酰胺，結果見表1。

表1 前胡揮發(fā)油的乙酰膽堿酯酶及丁酰膽堿酯酶抑制率Table 1 The inhibition ratio of acetyl cholinesterase and butyryl cholinesterase in the volatile oil of Radix Peucedani

1.2.3.3 前胡AChE-IC50和BuChE-IC50

吸取前胡揮發(fā)油3 μL，定容于3 mL 的DMSO中，濃度為1 μL/mL. 倍比稀釋為以下8 個濃度0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125 μL/mL。采用改良的Ellman 方法［11］:實驗設空白組，溶劑對照組，樣品組及陽性對照組，反應體系中各加入32 μL 酶液、160 μL 不同濃度的供試品溶液揮發(fā)油抑制劑(溶劑對照組抑制劑為1‰DMSO，陽性對照組抑制劑分別為濃度1 mg/mL 陽性藥他克林和四異丙基甲基焦磷酰胺)和400 μL 顯色劑DTNB(空白組在加完DTNB 后加入400 μL SDS 終止反應)，補水至1.2 mL，37 ℃孵育5 min，加入底物400 μL ATCH(碘化硫代乙酰膽堿)37 ℃孵育15 min，再加入400 μLSDS 終止反應，用酶標儀在波長為412 nm 處測定吸光度值，分別計算乙酰膽堿酯酶抑制率，乙酰膽堿酯酶抑制率(%)={1-(A 樣本-A 空白)/(A 對照-A 空白)}×100%。實驗重復三次，結果見表3。根據改良寇式法計算出其IC50:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm。其中l(wèi)g 為 最大劑量，I 為l g(最大劑量/ 相臨劑量)，P 為陽性反應率之和，Pm為最大陽性反應率，Pn 為最小陽性反應率，實驗結果見表2。

表2 前胡揮發(fā)油的AChE-IC50和BuChE-IC50值Table 2 the value of AChE-IC50 andBuChE-IC50in the volatile oil of Radix Peucedani

1.2.4 GC-MS 對前胡揮發(fā)油化學成分的結構確定

1.2.4.1 色譜條件

色譜柱DB-5 毛細管石英柱(0.32 mm ×30 m，0.25 μm，Agilent 公司)

檢測器溫度:300 ℃，氣化室溫度:300 ℃，柱前壓:137.2 kpa，載氣:He，載氣流速:1.0 mL/min，尾氣流速:50 mL/min，進樣方式:分流進樣，分流比:1:50，進樣量1 μL。

程序升溫:40 ℃保持10 min，以1 ℃/min 至45℃，保持1min;以12 ℃/min 至220 ℃，保持2 min;以3 ℃/min 至290 ℃，保持1 min。進樣口溫度:300 ℃。質譜條件:EI 源，電離能量:70 eV，離子源溫度:230 ℃。掃描范圍:m/z 35～450。

1.2.4.2 樣品的測定

取前胡揮發(fā)油供試品1 μL，按上述優(yōu)化后的GC-MS 條件進樣測定?？傠x子流圖見圖1。

圖1 前胡揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 Total Ion Chromatogram of the volatile oil in Radix Peucedani

1.2.4.3 揮發(fā)油化學成分結構確定

通過GC-MS 質譜庫與保留指數聯合定性從前胡揮發(fā)油中鑒定出32 種主要化學成分，以面積歸一法計算，占總峰面積的88.34%，主要成分有α-蒎烯，左旋-β-蒎烯，月桂烯，1-甲基-3-(1-甲基乙基)苯，(R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯，2-癸酮，萜品醇，2-羥基-5-甲基苯乙酮，柏木腦等，詳見表3。

表3 前胡揮發(fā)油主要化學成分Table 3 The main chemical constituents in volatile oil of Radix Peucedani

2 結論與討論

2.1 GC-MS 質譜庫結合Kovats 指數鑒定揮發(fā)油結構更準確

2.2 前胡有可能成為抗老年癡呆的候選藥物

前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dumn 的干燥根，具有散風清熱，降氣化痰的功效，用于治療風熱咳嗽痰多，痰熱喘滿，咯痰黃稠［22］。現代藥理研究表明前胡還具有抗心臟缺血、保護心肌、改善心臟功能、擴張血管、降低血壓、抗氧化等多種活性［23］。本文以薄層色譜(TLC)-生物自顯影技術及微孔高通量篩選方法研究前胡膽堿酯酶抑制活性，結果表明前胡揮發(fā)油對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶均具有抑制作用。本文研究結果提示前胡有可能對老年癡呆等神經退行性疾病有一定的治療作用。

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