劉衛(wèi)根，王亮生，周國英 ，徐文華，楊路存，宋文珠

1中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進化重點實驗室，西寧810008;2 中國科學(xué)院植物研究所植物園，北京100093;3 中國科學(xué)院研究生院，北京100049

羌活原植物為傘形科羌活屬植物羌活(Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang)和寬葉羌活(N.forbesii H. Boiss.)，以其干燥根莖和根入藥［1］，為歷版藥典收載，主要分布于青海、四川、甘肅和云南一帶［2］。羌活是中、藏、羌醫(yī)藥體系中的常用藥材，其藥用歷史悠久，藥理作用廣泛，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、散寒、祛風(fēng)、除濕等多種功效，對心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病也具有一定的療效［3］。除藥典中規(guī)定的上述兩種植物外，產(chǎn)自陜西的下延棱子芩(Pleurospermum decurrens)［4］、云南的心葉棱子芩(Pleurospermum rivulorum)［5］和翼羽輪芩(Pterocyclus rivulorum)［4］、四川的大前胡(Angelica sylvestris)［4］和紫傘芹(Melauosciadium pimpinelloideum Boissieu)［6］、東北的朝鮮羌活(Angelica koreana)［4］、新疆的林當(dāng)歸(Angelica silvestris L.)［7］和灰綠葉 當(dāng) 歸(Angelica glauca Edgew.)［8］等品種在市場上往往被用作羌活的混用品或地方習(xí)用品，它們與羌活性味相差甚遠，均不能充當(dāng)羌活應(yīng)用。

羌活中含有揮發(fā)油、有機酸和香豆素等多類活性成分，目前關(guān)于羌活和寬葉羌活根部活性成分的提取分離、含量測定方面的研究已有大量文獻報道［9-11］，也有學(xué)者對羌活的混用品和地方習(xí)用品進行了相關(guān)研究［5，8］。胡敏燕［12］等和王小仙［13］等分別對不同時間采收的和不同時間采購的羌活根部揮發(fā)油的含量進行了比較。目前關(guān)于寬葉羌活不同部位中有機酸和香豆素類化合物含量測定方面的研究尚未報道。因此，本實驗采用HPLC-DAD 法同時測定寬葉羌活的根(包括根和根莖，以下簡稱根)、莖、葉片、葉柄和種子5 個部位中綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇和異歐前胡素的含量，探究寬葉羌活中這些常見的有機酸和香豆素類化合物的含量和分布特征，并和羌活進行比較，以期為羌活資源的合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

寬葉羌活于2010 年8 月采自青海省門源縣和樂都縣，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所周國英副研究員鑒定為傘形科植物寬葉羌活(N.forbesii H.Boiss.)。將各部位樣品(根、莖、葉、葉柄、種子)仔細分揀，自然陰干，稱重，粉碎至100 目左右備用。

1.2 儀器與試劑

儀器:戴安(Dionex)HPLC-DAD 分析系統(tǒng)，包括P680 泵、UltiMate 3000 自動進樣器、TCC-100 柱溫箱、PDA-100 光電二極管陣列檢測器及Chromeleon(6.60 版本)變色龍色譜工作站。色譜柱為C18TSK gel ODS-80Ts QA(250 mm × 4. 6 mm，i. d. 5 μm，Tosoh Co.Ltd.，日本)。

試劑:有機溶劑包括分析純甲醇、冰醋酸(北京化工廠，中國);色譜純甲醇和乙腈(MREDA TECHNOLOGY INC.，USA)，HPLC 級超純水由Milli-Q 超純水系統(tǒng)(Millipore，Billerica，MA，USA)制備。對照品阿魏酸(批號:110773-201012)和歐前胡素(批號:110826-201013)購自中國食品藥品檢定研究院;補骨脂素(批號:110322)和佛手柑內(nèi)酯(批號:110215)購自上海順勃生物工程有限公司;綠原酸(批號:ps08072303 )、紫花前胡苷(批號:ps11032301)、異歐前胡素(批號:ps08040301)、羌活醇(批號:ps11050601)購自成都普斯生物科技有限公司，各標(biāo)準(zhǔn)品純度均在98%以上。

1.3 色譜分析方法

采用高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLCDAD)測定寬葉羌活不同部位中8 種活性成分的含量(含量測定方法由本課題組建立，另文報道，文章已接收［14］)。

1.3.1 色譜條件

流動相A 相為純甲醇，B 相為0.3%的冰醋酸水溶液，梯度洗脫程序為:0～15 min，25%～38%A;15～17 min，38%～38%A;17～45 min，38%～50%A;45～55 min，50%～75%A;55～70 min，75%～85%A;70～75 min，85%～25%A，75～80 min，25%～25% A。流速:0. 6 mL/min，進樣量:10 μL。柱溫:30 ℃;檢測波長:336 nm(紫花前胡苷)，325 nm(綠原酸和阿魏酸)，310 nm(佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素、歐前胡素)，295 nm(補骨脂素)。對照品和樂都寬葉羌活不同部位樣品的色譜圖見圖1。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇、異歐前胡素各適量，以甲醇溶解，搖勻并定容，制成含綠原酸(408.00 μg·mL-1)、阿魏酸(400.00 μg·mL-1)、紫花前胡苷(400.00 μg·mL-1)、補骨脂素(405.00 μg·mL-1)、佛手柑內(nèi)酯(404.00 μg·mL-1)、歐前胡素(403.00 μg·mL-1)、羌活醇(400.00 μg·mL-1)、異歐前胡素(400.00 μg·mL-1)混合對照品儲備液。

1.3.3 供試品溶液的制備

取分離后各部位樣品粉末各約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

圖1 混合對照品(A，325 nm)、樂都寬葉羌活根(B，325 nm)、莖(C，325 nm)、葉片(D，325 nm)、葉柄(E，336，325，310，295 nm)、種子(F，325 nm)的高效液相色譜圖1.綠原酸;2.阿魏酸;3.紫花前胡苷;4.補骨脂素;5.佛手柑內(nèi)酯;6.歐前胡素;7.羌活醇;8.異歐前胡素Fig.1 HPLC chromatograms of the mixed reference compounds (A，325 nm)，root and rhizome (B，325 nm)，stem (C，325 nm)，leaf(D，325 nm)，petiole (E，336，325，310，295 nm)and seed (F，325 nm)of N. forbesii collected from Ledu.1. chlorogenic acid;2.ferulic acid;3.nodakenin;4.psoralen;5.bergapten;6.imperatorin;7.notopterol;8.isoimperatorin.

1.3.4 線性關(guān)系考察

精密量取“1.3.2”項下的混合對照品母液5，2.5，2 mL，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，然后采用逐級稀釋的方法，用甲醇將上述不同濃度的混標(biāo)(包括母液)分別稀釋10n倍(n =1，2，3)，得到一系列不同濃度的混合對照品溶液。每個濃度平行進樣3 針，進樣量為10 μL，以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，平均峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各對照品的回歸方程。各對照品的線性回歸方程分別為:綠原酸(Y = 540.7X –1.142，R2= 0.9999，線性范圍2.04～102.00 μg·mL-1);阿魏酸(Y = 1591.2X + 0.5318，R2= 0.9999，線性范圍0.40～40.00 μg·mL-1);紫花前胡苷(Y =808.4X－1.0392，R2= 0.9992，線性范圍0.80～400. 00 μg·mL-1);補骨脂 素(Y = 1058. 6X－0.0759，R2= 0.9997，線性范圍0.20～40.50 μg·mL-1);佛手柑內(nèi)酯(Y = 1137.5X－0.0486，R2=0.9998，線性范圍0.20～40.40 μg·mL-1);歐前胡素(Y = 845.4X + 0.1112，R2= 0.9995，線性范圍2.01～40.30 μg·mL-1);羌活醇(Y = 663.7X－0.2378，R2= 0.9999，線性范圍0.40～400.00 μg·mL-1);異歐前胡素(Y = 955.9X + 0.9342，R2= 0.9996，線性范圍0.20～400.00 μg·mL-1)。1.3.5 精密度試驗

對同一對照品溶液，在同一色譜條件下，連續(xù)進樣5 次，得綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇、異歐前胡素濃度的RSD 值分別 為1. 62%、0. 49%、3. 39%、0. 27%、0.12%、3.33%、0.34%、1.05%。

1.3.6 重復(fù)性試驗

取同一樣品，稱取6 份，各約0.4 g，精密稱定，分別制備供試品溶液，并進行測定，結(jié)果表明，綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇、異歐前胡素6 次測定值的RSD 分別為2.36%、2.17%、3.19%、未知、1.78%、未知、1.32%、1.56%。

1.3.7 穩(wěn)定性試驗

取同一對照品溶液，根據(jù)上述色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h 進樣分析，根據(jù)峰面積計算混合儲備液中綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇和異歐前胡素的濃度，RSD 分 別 為1. 97%、0. 52%、1. 86%、1. 71%、0.64%、2.22%、1.01%、1.51%，表明24 h 內(nèi)8 個對照品穩(wěn)定性良好。

1.3.8 回收率試驗

采用加樣回收法，精密吸取已知含量的羌活根粉末0.1 g，分別精密加入已知量高、中、低3 種質(zhì)量濃度的對照儲備液，按供試品溶液制備方法進行操作，并按2.1 項色譜條件進樣分析，計算回收率。結(jié)果表明，綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇、異歐前胡素的回收率分別 為96. 27%、97. 81%、102. 44%、99. 10%、96.63%、99.57%、101.04%、102.37%，RSD 值分別為1. 58%、2. 94%、4. 14%、1. 75%、3. 02%、2.53%、2.30%、1.21%。

1.3.9 樣品測定

精密稱取不同部位樣品粉末各約0. 4 g，按1.3.3 項方法制備供試液，按照1.3.1 項下色譜條件注入液相色譜儀，每批平行測定3 次，記錄色譜峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸和阿魏酸的含量測定結(jié)果

綠原酸和阿魏酸是羌活中兩種含量較高的有機酸，其測定結(jié)果見表1。由表1 可知，門源產(chǎn)寬葉羌活不同部位中綠原酸的含量由高到低依次為根(6.139 mg·g-1)＞種子(5. 343 mg·g-1)＞葉柄(3.377 mg·g-1)＞葉片(3. 216 mg·g-1)＞莖(2.615 mg·g-1)，樂都產(chǎn)寬葉羌活不同部位中綠原酸的含量由高到低依次為種子(7.199 mg·g-1)＞根(6. 479 mg·g-1)＞葉片(3. 652 mg·g-1)＞莖(2.127 mg·g-1)＞葉柄(1.988 mg·g-1)。門源產(chǎn)寬葉羌活根中綠原酸含量最高，其次為種子，莖中綠原酸含量最低;樂都產(chǎn)寬葉羌活種子中綠原酸含量最高，其次為根，葉柄中綠原酸含量最低。

表1 寬葉羌活不同部位中綠原酸和阿魏酸的含量測定結(jié)果Table 1 Concentrations of chlorogenic acid and ferulic acid detected in different parts of N.forbesii collected from Menyuan and Ledu

門源和樂都產(chǎn)寬葉羌活阿魏酸含量最高的部位均為根(含量分別為0.639 mg·g-1和0.916 mg·g-1)，其次均為莖(0.132 mg·g-1和0.074 mg·g-1)，門源和樂都產(chǎn)寬葉羌活的葉片和種子以及樂都產(chǎn)寬葉羌活的葉柄中阿魏酸含量因低于定量限而未定量。兩種產(chǎn)地寬葉羌活根中阿魏酸的含量均顯著高于其他部位，莖中活性成分總含量雖較低，但其阿魏酸的含量高于地上部分其他部位。

2.2 紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素的測定結(jié)果

紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、羌活醇和異歐前胡素等均為羌活的有效成分［15，16］，這些活性成分的測定對于評價羌活藥材的品質(zhì)具有重要意義。

表2 寬葉羌活不同部位中紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素的含量測定結(jié)果Table 2 Concentrations of nodakenin，psoralen，bergapten and imperatorin detected in different parts of N.forbesii collected from Menyuan and Ledu

由表2 測定結(jié)果可知，門源產(chǎn)寬葉羌活不同部位中紫花前胡苷的含量由高到低依次為根(31.445 mg·g-1)＞莖(2.062 mg·g-1)＞葉柄(1.358 mg·g-1)＞葉片(0. 519 mg·g-1)＞種子(0. 359 mg·g-1);樂都產(chǎn)寬葉羌活不同部位中紫花前胡苷的含量由高到低依次為根(49.700 mg·g-1)＞莖(1.065 mg·g-1)＞種子(0.883 mg·g-1)＞葉柄(0.0.595 mg·g-1)＞葉片(0.234 mg·g-1)。兩種產(chǎn)地寬葉羌活中紫花前胡苷含量最高的部位均為根(含量分別為31.445 mg·g-1和49.700 mg·g-1)，其次均為莖(2.062 mg·g-1和1.065 mg·g-1)。有文獻報道［2］曾從羌活乙醇提取部分分離得到了補骨脂素，李云霞［15］等對羌活超臨界CO2提取物進行分離與鑒定，得到了香豆素類化合物歐前胡素，門源和樂都產(chǎn)寬葉羌活不同部位中均未檢測出這兩種成分，這可能與基源植物、產(chǎn)地、提取方法等不同等有關(guān)。佛手柑內(nèi)酯的含量也較低，兩種產(chǎn)地寬葉羌活中均僅測出根中佛手柑內(nèi)酯的含量(0.167 mg·g-1和0.243 mg·g-1)，其他部位該成分由于低于檢測限(或定量限)而未被檢出(或不能準(zhǔn)確定量)。

2.3 羌活醇和異歐前胡素的含量測定結(jié)果

羌活中羌活醇和異歐前胡素的含量較高，它們是評價該藥材質(zhì)量的兩個重要指標(biāo)。2010 年版《中國藥典》［1］規(guī)定按干燥品計算，羌活中羌活醇和異歐前胡素的總量不得低于0.4%(4 mg·g-1)。

表3 寬葉羌活不同部位中羌活醇和異歐前胡素的含量測定結(jié)果Table 3 Concentrations of notopterol and isoimperatorin detected in different parts of N.forbesii collected from Menyuan and Ledu

由表3 測定結(jié)果可知，門源和樂都產(chǎn)寬葉羌活不同部位中羌活醇的含量由高到低均依次為根(含量分別為0.322 mg·g-1和0.561 mg·g-1，下同)＞種子(0. 208 mg·g-1和0. 297 mg·g-1)＞葉柄(0.181 mg·g-1和0.188 mg·g-1)＞葉片(0.175 mg·g-1和0.153 mg·g-1)＞莖(0.083 mg·g-1和微量)。門源和樂都產(chǎn)寬葉羌活不同部位中異歐前胡素的含量由高到低均依次為根(14.100 mg·g-1和22.205 mg·g-1)＞種子(4.960 mg·g-1和9.382 mg·g-1)＞葉柄(1.583 mg·g-1和1.030 mg·g-1)＞葉片(1.141 mg·g-1和0.503 mg·g-1)＞莖(1.017 mg·g-1和0.366 mg·g-1)。兩種產(chǎn)地寬葉羌活根中羌活醇和異歐前胡素的含量之和均遠高于藥典所規(guī)定的最低標(biāo)準(zhǔn);地上部分中，只有種子中二者含量之和達到藥典要求，說明以寬葉羌活根莖及根入藥的傳統(tǒng)方法具有一定的合理性。

2.4 寬葉羌活和羌活不同部位中主要活性成分含量的比較

根據(jù)本課題前期的試驗結(jié)果［17］，我們發(fā)現(xiàn)門源和樂都產(chǎn)羌活根中活性成分含量最高的3 種成分均為羌活醇＞綠原酸＞異歐前胡素，地上部分各部位中含量最高的成分均為綠原酸(門源產(chǎn)羌活葉片除外)。本實驗的結(jié)果表明，門源和樂都產(chǎn)寬葉羌活根中活性成分含量最高的3 種成分均為紫花前胡苷＞異歐前胡素＞綠原酸，地上部分各部位中含量最高的成分也均為綠原酸。羌活和寬葉羌活根部活性成分的總含量均顯著高于其他部位。對于地上部分，羌活的葉片和葉柄中活性成分的總含量高于種子和莖中活性成分的總含量;而寬葉羌活種子中活性成分的總含量高于地上部分其他部位。

寬葉羌活根中紫花前胡苷的含量明顯高于羌活，其異歐前胡素的含量也較羌活高，但其羌活醇的含量卻顯著低于羌活。寬葉羌活根、莖、葉片和葉柄中綠原酸的含量與羌活相應(yīng)部位的含量相差不大，但寬葉羌活種子中綠原酸的含量遠高于羌活，其含量與根中綠原酸的含量相近。此外，根中含量較高的羌活醇、異歐前胡素和紫花前胡苷在地上部分其他部位中的含量均很低，甚至要低于其他成分的含量。門源和樂都產(chǎn)寬葉羌活和羌活地上部分各部位中含量最高的均為綠原酸(樂都產(chǎn)寬葉羌活種子和門源產(chǎn)羌活葉片除外)，這說明羌活醇、異歐前胡素和紫花前胡苷主要富集在根部，綠原酸在全草中均廣泛分布。

3 討論

門源產(chǎn)寬葉羌活不同部位中所測活性成分總含量由高到低依次為根(52.812 mg·g-1)＞種子(10.870 mg·g-1)＞葉柄(6.607 mg·g-1)＞莖(5.909 mg·g-1)＞葉片(5.051 mg·g-1)，樂都產(chǎn)寬葉羌活不同部位中所測活性成分總含量由高到低依次為根(80.104 mg·g-1)＞種子(17.761 mg·g-1)＞葉片(4.542 mg·g-1)＞葉柄(3.801 mg·g-1)＞莖(3.632 mg·g-1)。寬葉羌活和羌活均為傘形科多年生草本植物，根和根莖粗壯，圓柱形或不規(guī)則塊狀，二者根的形態(tài)相似，不易區(qū)分。兩種產(chǎn)地寬葉羌活和羌活根部活性成分總含量均明顯高于其他部位，門源和樂都產(chǎn)寬葉羌活根部活性成分總含量比其他部位分別高4.9～10.5 倍和4.5～22.1 倍，羌活根部活性成分總含量比其他部位分別高5.4～38.4 倍和4.7～21.8 倍，這與傳統(tǒng)上以其根莖及根入藥相符。

不同基源植物、同一植物不同部位各活性成分的含量均存在一定的差異。寬葉羌活中含量較高的成分為紫花前胡苷、異歐前胡素和綠原酸等，羌活中含量較高的成分有羌活醇、綠原酸和異歐前胡素等。寬葉羌活中紫花前胡苷的含量明顯高于羌活，異歐前胡素的含量也較后者高，而其羌活醇的含量顯著低于羌活。紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素等主要富集于根部，綠原酸在全草中均廣泛分布，阿魏酸、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素的含量均較低。

藥典中規(guī)定羌活中羌活醇和異歐前胡素的總量不得低于0.4%(4 mg·g-1)，本實驗兩種產(chǎn)地寬葉羌活根中羌活醇和異歐前胡素的總含量均遠遠高于藥典所規(guī)定的最低標(biāo)準(zhǔn)，地上部分的種子中二者的含量之和(5.168 mg·g-1和9.679 mg·g-1)也達到要求，說明寬葉羌活種子也具有較高的藥用價值。莖中活性成分總含量雖較低，但兩種產(chǎn)地寬葉羌活莖中阿魏酸和紫花前胡苷的含量高于地上部分其他部位。莖、葉片和葉柄色譜圖中也存在一些含量較高的未知峰，這些化學(xué)成分的分離和鑒定及其藥理活性的評價有待于進一步的研究。

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