李培林

（1. 哈佛大學(xué) 醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系， 波士頓 MA 02115； 2. 加州大學(xué)舊金山分校 醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系， 舊金山 CA 94121）

Nef 蛋白是人類免疫缺陷病毒（HIV）中一個全長27～35 ku 的輔助蛋白， 與提高病毒載量和病情惡化有關(guān)， 在病毒生命周期的早期階段表達， 需要經(jīng)過磷酸化和豆蔻?；拍艹墒欤?］。 在體外， Nef 蛋白能夠增強HIV 在未刺激的外周血單核細胞（PBMC）和CD4＋T 細胞中的復(fù)制［2－3］， 有向下調(diào)節(jié)細胞表面分子表達的功能，如CD4 主要組織相容性復(fù)合體 （MHC）I， 趨化因子受體4 型（CXCR－4）， 和CC 趨化因子受體5 型等分子［4－6］。Nef 蛋白和宿主的細胞蛋白之間有很多相互作用， Nef 蛋白和酪氨酸以及絲氨酸蛋白激酶家族成員的相互作用， 能夠改變細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和提高病毒的復(fù)制［7－9］。

研究表明， 絲氨酸蛋白激酶磷酸化Nef 蛋白有助于調(diào)節(jié)Nef 蛋白的功能。 絲氨酸激酶磷酸化胺基端的Nef 能夠影響病毒的傳染性， 蛋白激酶C（PKC）是一個絲氨酸家族蛋白激酶， 磷酸化Nef蛋白能夠增強其下調(diào)CD4 的功能［10－11］。PKA 是一個關(guān)鍵的絲氨酸蛋白激酶， 參與環(huán)磷酸腺苷（cAMP） 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， 參與調(diào)節(jié)T 細胞的功能［12］。 增加PKA 活性可以提高HIV 轉(zhuǎn)錄和病毒的復(fù)制［13－15］。 此外， HIV 陽性患者的T 細胞中cAMP／PKA 活性有顯著增加， T 細胞功能受損。降低細胞內(nèi)PKA 的活性可以恢復(fù)HIV 陽性患者的T 細胞功能［16－17］。 C. Cartier 等［18］研究表明PKA和HIV 之間的有明顯的聯(lián)系， 在一個病毒單周期的實驗中， 表明PKA 被HIV 納入了病毒內(nèi)， 對HIV 的傳染性和復(fù)制有重要的作用。

到目前為止， 有間接證據(jù)表明， PKA 涉及HIV 的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。 較早的研究［11］表明， PKA 對Nef 的磷酸化沒有影響， 主要是因為使用了佛波醇酯（PMA）， 一個PKC 的刺激物。 根據(jù)PKA 磷酸化生理底物的的共識網(wǎng)站［12］， 筆者發(fā)現(xiàn)在Nef蛋白9 號位置上的絲氨酸可能是PKA 磷酸化的位點。 筆者用這個信息來研究PKA 磷酸化Nef 蛋白對病毒復(fù)制的影響。 結(jié)果表明突變Nef 蛋白9號位置上絲氨酸PKA 磷酸化的位點， 可以影響靜態(tài)原代細胞中的HIV 復(fù)制。

1 材料和方法

1.1 Nef 區(qū)域內(nèi)的定點突變

采用QuikChange 定向突變試劑盒（Stratagene公司）， 根據(jù)制造商說明試驗， 筆者設(shè)計了一個HIV 全長（HIVNL4-3）的突變體： 只是把Nef 中9 號位置上的絲氨酸（Ser9）突變?yōu)楸彼幔?其他的HIV 基因保持和野生型的一樣（HIV S9A）。

1.2 Nef 蛋白的表達

用pcDNA6／myc－His／B 含有野生型（HIVNL4-3）的Nef 的質(zhì)粒， 單突變的Nef（S9A）的質(zhì)粒， 或者空載體的質(zhì)粒， 使用磷酸鈣哺乳動物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（Promega 公司） 去轉(zhuǎn)染293T 細胞。 在轉(zhuǎn)染72 h后， 去掉上清液， 用磷酸鹽緩沖液漂洗細胞一次， 用4 %的甲醛固定細胞， 用含有1 % Triton X－100 的磷酸鹽緩沖液漂洗細胞，然后在含有1%牛血清白蛋白和含有抗HIV Nef 單克隆抗體的磷酸鹽緩沖液4 ℃孵育過夜。 最后用羊抗鼠的IgG耦聯(lián)的辣根過氧化物酶 （HRP）（BIO－RAD 公司）和FAT DAB 片劑（Sigma 公司）顯示結(jié)果。

1.3 生產(chǎn)HIV

1） 生產(chǎn)HIV 用50 μg 的HIV 野生型的質(zhì)粒， 或者是50 μg 有Nef（Ser9）單一的突變HIV的質(zhì)粒， 使用磷酸鈣哺乳動物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（Promega公司）去轉(zhuǎn)染293T 細胞。

2） 生產(chǎn)Nef 蛋白被打包進Nef 刪除的HIV。用50 μg 的Nef 被刪除的HIV 的質(zhì)粒（HIVΔNef）和100 μg Nef 表達的質(zhì)粒一起使用磷酸鈣哺乳動物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（Promega 公司）轉(zhuǎn)染293T 細胞。

在轉(zhuǎn)染后72 h， 收獲上清液， 通過22－μm孔的過濾器 （Millipore 公司）， 用P24 抗原捕獲（Beckman Coulter 公司）方法去標準化。

1.4 病毒感染和復(fù)制檢測

1.4.1 病毒感染檢測 用一種對HIV 感染很敏感的TZM－BL 細胞來做病毒感染檢測， 檢查打包了不同Nef 蛋白Nef 刪除 （HIVΔNef） 的HIV病毒。 用3 倍稀釋的方法去感染細胞， 用含有40 μg／mL 的DEAE-葡聚糖（Sigma 公司）的培養(yǎng)基， 在96 孔板中進行。 在37 ℃，5%CO2的孵化箱中孵育6 h， 加入病毒融合抑制劑T－20（AnaSpec 公司） 2 μg／mL。 繼續(xù)孵化48 h， 每孔加入100 μL 的光明GLO 熒光素酶檢測系統(tǒng)（Promega 公司） 測量熒光素酶的活性， 用Wallac Victor2 1420 多標記計數(shù)器 （Perkin－Elmer 公司）去讀取熒光素酶活性。 所有的病毒感染檢測， 一式3 份。

1.4.2 病毒復(fù)制檢測 外周血單核細胞（PBMC）用Ficoll 密度梯度離心的方法從匿名捐獻者血液中提取。 靜息外周血單核細胞暴露在病毒3 h后， 用完全培養(yǎng)基（RPMI 1640 培養(yǎng)液與10 %胎牛血清， 100 U／mL 青霉素， 100 μg／mL 鏈霉素，2 mM 谷氨酰胺）洗凈3 次， 然后懸浮在新鮮的完全培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)在37 ℃，5%CO2的孵化箱中，在感染4 d 后， 用植物血凝素 （PHA， 3 μg／mL）（Sigma 公司）和5 U 的重組白細胞介素－2（rIL－2）（Roche 公司）去刺激PBMC 1 d。 然后把細胞放在新鮮的含有5 U 的重組白細胞介素－2 （rIL－2）培養(yǎng)基里培養(yǎng)。 定期收集上清液和更換新鮮培養(yǎng)基， 并測定P24 Gag 蛋白水平。 所有的病毒復(fù)制試驗， 一式3 份。

1.5 統(tǒng)計分析

t 檢驗進行數(shù)據(jù)分析， 使用Bonferroni 多重比較校正后的表示。

2 結(jié)果

由于Nef 的重要職能之一是加強病毒的復(fù)制性［19－20］， 為了檢測Nef 中9 號位置上的絲氨酸（Ser9）PKA 磷酸化位點對病毒復(fù)制的影響。 用全長的野生型病毒的DNA （HIVNL4-3）， 使用定點突變方法， 筆者構(gòu)建了一個只有在Nef 有變異的HIV 變種， 是一個含有單個PKA 磷酸化位點（Ser9）的基因突變型（HIV－S9A）， 這個HIV 變異用DNA 測序證實， 該突變HIV 只是將Nef 9 位置（Ser9）上的絲氨酸改變?yōu)楸彼幔?沒有其他的病毒基因改變。 作為一個Nef 陰性對照， 使用一個Nef 刪除的HIV 克?。?］。 然后， 用野生型或突變型的病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細胞產(chǎn)生病毒， 3 d 后收獲上清液， 用P24 測定標準化。 當用等效劑量的HIV 去感染被刺激后的人外周血單核細胞時，無論是野生型HIV （HIVNL4-3）， 還是HIV S9A單突變型 （HIV－S9A）， 對HIV 的復(fù)制都沒有影響。 這個結(jié)果表明Nef 的突變對刺激后外周血單核細胞中HIV 復(fù)制沒有影響（見圖1）。

圖1 HIV 感染刺激后的PBMC

圖1 表明， 相比野生型的HIV 病毒， Nef 蛋白的一個PKA 磷酸化位點的突變不減少病毒的復(fù)制。 P24 的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

根據(jù)其他研究［1－3］， 一般Nef 對病毒復(fù)制的增強功能是在病毒感染沒有被刺激的人外周血單核細胞時觀察到的。 因此， 筆者以P24 為標準用相同劑量的病毒， 包括野生型或Nef 突變型， 去感染沒有被刺激的人外周血單核細胞， 4 d 后再刺激細胞， 在感染第10 天檢查HIV 的復(fù)制， 和野生型HIV （HIVNL4－3） 相比較， Nef 突變病毒S9AHIV （HIV－S9A）， 以及Nef 刪除的HIV（HIVΔNef）復(fù)制的水平顯著降低， （P ＜0.03， P ＜0.01， P ＜0.01）， 同時， Nef 突變病毒S9AHIV（S9A）和Nef 刪除HIV（HIVΔNef）之間的復(fù)制水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）（見圖2）。 該結(jié)果表明， Nef 中9 號位置上的絲氨酸對靜態(tài)原代細胞中病毒的復(fù)制有關(guān)鍵作用， 但是9 號位置以外的區(qū)域?qū)Σ《緩?fù)制也有影響。

圖2 HIV 感染沒有刺激的PBMC

由圖2 可知， 相比野生型的HIV 病毒來看，Nef 蛋白的一個PKA 磷酸化位點的突變可以減少病毒的復(fù)制。 感染后第10 天的病毒產(chǎn)生：包括野生型（HIVNL4－3， 實心柱）， 單突變型（HIV－S9A，空心柱虛線）， 或Nef 刪除型 （HIVΔNef， 空心柱實線）。 用檢測P24 釋放到上清的方法測定病毒的復(fù)制。 結(jié)果顯示了從3 個不同的捐助者， 3 次獨立的外周血單核細胞感染后生產(chǎn)的P24。 單突變型（HIV－S9A）和Nef 刪除型（HIVΔNef）病毒產(chǎn)量顯著下降， 和野生型HIV 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）， 另外單突變型（HIV－S9A）和Nef刪除型（HIVΔNef）之間的病毒產(chǎn)量差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。

為了進一步確定病毒輸出的減少是由于去除掉了Nef 的PKA 磷酸化位點， 筆者直接研究這些Nef 突變對病毒復(fù)制的影響， 使用Nef 刪除HIV 和Nef 蛋白質(zhì)進行重組。 有實驗表明， 使用Nef 刪除HIV 的DNA 或野生型HIV 的DNA 產(chǎn)生的病毒［2－3］， 去感染沒有被刺激的人外周血單核細胞， Nef 刪除HIV 的復(fù)制和野生型HIV 相比有明顯的下降， 但是如果給Nef 刪除的HIV 補充Nef 蛋白， 可以糾正這種下降， 使病毒的復(fù)制恢復(fù)到野生型HIV 復(fù)制的水平。 在這種情況下，Nef 是打包在病毒裝配的病毒顆粒里， 但是病毒在復(fù)制第一個周期以后沒有進一步產(chǎn)生Nef 的能力［1，19－21］。 筆者用共同表達的方式， 用Nef 刪除HIV 的DNA、 野生型或者是Nef 基因突變型的DNA， 去轉(zhuǎn)染293T 細胞， 將生產(chǎn)的Nef 蛋白打包進Nef 刪除的HIV 病毒顆粒里， 病毒沒有自己產(chǎn)生Nef 的能力。 轉(zhuǎn)染細胞后， 收集共同表達的上清液， 分下面幾種情況： 刪除Nef HIV 的DNA， ①和野生型的Nef 基因 （HIVΔNef＋Nef），②和單突變的Nef 基因（HIVΔNef＋Nef 的S9A），③和空的載體（HIVΔNef＋vector）， 病毒的產(chǎn)生用測量P24 的產(chǎn)生量進行。 Nef 蛋白的表達， 用免疫細胞化學(xué)方法檢查， 結(jié)果表明野生型的Nef 蛋白和單突變的Nef 蛋白表達水平在293T 細胞里是基本相等的， 但是空的載體沒有蛋白表達 （見圖3）。

下一步， 用等效的P24 劑量去感染沒有被刺激的人外周血單核細胞， 用的病毒是HIVΔNef＋Nef， HIVΔNef＋NefS9A， 或HIVΔNef＋vector。 這是與Nef 有關(guān)的單周期病毒感染檢測。

病毒復(fù)制結(jié)果顯示， 病毒含有單突變的Nef（HIVΔNef ＋NefS9A） 和病毒含有野生型Nef（HIVΔNef＋Nef） 相比較， 病毒的復(fù)制率明顯降低（P ＜0.001， 用Bonferroni 校正后）（見圖4）。 用3 個不同的捐助者的人外周血單核細胞檢測獲得了相同的結(jié)果。

圖3 Nef 蛋白的表達

圖4 Nef 的單周期的病毒復(fù)制檢測

圖4 表明， 用Nef 的單周期病毒感染檢測方法表明磷酸化位點被突變的Nef 蛋白降低了HIV的復(fù)制。 含有空載體的Nef 刪除HIV（HIVΔNef＋vector， 帶方型的線）， 和含有單突變Nef 蛋白（Nef S9A）的Nef 刪除HIV（HIVΔNef＋NefS9A， 帶圓圈的線）減少了病毒的復(fù)制， 與含有野生型Nef蛋白的Nef 刪除HIV （HIV Nef＋Nef， 帶三角的線） 比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜0.001， 經(jīng)過Bonferroni 校正）。

由于病毒含有單突變的Nef （HIVΔNef ＋NefS9A） 蛋白的復(fù)制水平和病毒不含有Nef 蛋白的復(fù)制顯示相同的降低級別， 筆者認為， 把Nef 9 號位置 （Ser9） 上的絲氨酸改變成為丙氨酸（Ala9）的單點突變足以廢除Nef 增強在未刺激的原代細胞中對病毒復(fù)制的作用。

為了進一步研究Nef 突變使病毒復(fù)制下降是由于病毒感染性的變化， 用了一個單周期的病毒感染檢測。 筆者采用TZM－BL 細胞， 這是一個對HIV 感染高度敏感的細胞株［22］。 經(jīng)過6 h 病毒和細胞接觸后， 加入了病毒融合抑制劑T20 到細胞上防止病毒進一步感染。 因此， 這個試驗提供了單周期的病毒感染檢測， 采用了同樣的病毒和病毒所含有各種Nef 蛋白。

筆者觀察到， 病毒含有不同的Nef 蛋白對病毒的感染沒有明顯的影響， 無論是病毒含有野生型Nef 蛋白（HIVΔNef＋Nef）、 病毒含有單突變的Nef 蛋白（HIVΔNef＋NefS9A）或是病毒含有空的載體（HIVΔNef＋vector）（見圖5）。

在感染48 h 后， 測量熒光素酶的活性。 圖5表明， 含有野生型Nef 蛋白的Nef 刪除HIV（HIVΔNef＋Nef） 的感染率、 含有空載體的Nef 刪除HIV（HIVΔNef＋vector）的感染率和含有單突變Nef 蛋白的Nef 刪除HIV（HIVΔNef＋NefS9A）的感染率基本相同， 差異沒有統(tǒng)計意義。 該研究結(jié)果表明病毒含有突變Nef 蛋白的減少病毒效應(yīng)在未刺激原代細胞中的產(chǎn)生是因為突變的Nef 蛋白對病毒復(fù)制的影響， 而不是對病毒傳染性的影響。

圖5 單周期的病毒感染檢測

3 討論

筆者觀察到， 當只改變Nef 中Ser9 位點時，會明顯降低Nef 增強未刺激的原代細胞中病毒復(fù)制的作用。 這個特殊現(xiàn)象在一個單周期的病毒檢測中， 通過將野生型或突變Nef 蛋白打包在病毒顆粒里的研究得到了證實。 因此， 可以確定蛋白激酶PKA 導(dǎo)致的Nef Ser9 位點的磷酸化， 對Nef蛋白增強未刺激的原代細胞中HIV 復(fù)制有重要作用。 由于Nef 蛋白Ser9 點突變對病毒復(fù)制有較大影響， 筆者推測， Nef 的蛋白激酶PKA 的磷酸化是在細胞中病毒生命周期的重要一步。

HIV Nef（S9）的蛋白激酶PKA 的磷酸化位點是很保守的， 筆者通過HIV 基因銀行（http：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／entrez）審查HIV 的M、N 和O 組序列， 其中M 組包括分支A、B、C、D、F 株和HIV 重組菌株A／D、 A／G， 發(fā)現(xiàn)至少有2 530種不同的Nef 序列， 其中約有76.5 %的HIV 的Nef 基因含有該位點。 此外， 有HIV DNA 序列的研究［23］指出在186 個HIV（HIV-1）中Nef（S9）有80 %的保守率。 綜合這些結(jié)果顯示， Nef（S9）蛋白激酶PKA 磷酸化位點可能是HIV Nef 重要的功能部位。 蛋白激酶PKA 和Nef 都有肉豆蔻酸側(cè)鏈嵌入細胞膜的脂筏中［24-27］。 脂筏是一個專門的微區(qū)域， 其高度富集膽固醇和鞘脂， 存在于細胞膜上， 是T 細胞信號傳遞和關(guān)鍵分子在細胞膜聚集的地方［28］， HIV 病毒顆粒從被感染的細胞釋放也是從脂筏產(chǎn)生的［29］。 HIV 的Nef 蛋白被蛋白激酶PKA 的磷酸化可能發(fā)生在脂筏中， 可能是在病毒顆粒裝配時， 也可能是在病毒入侵時。 總之，蛋白激酶PKA 和HIV Nef 蛋白的相互作用， 為研究HIV 感染的預(yù)防和治療提供了一個新方向。

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