摘 要： 本研究望能為其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)等方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。研究方法如下：利用搖瓶培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)硫酸銨鹽析、2次SephadexG-100柱純化，用殼聚糖進(jìn)行固定化。結(jié)果是粗酶液被純化，以戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化酶，得出結(jié)論：褐色高溫單孢菌PE-211纖維素酶經(jīng)硫酸銨鹽析、2次SephadexG-100柱純化，粗酶液被純化47.5倍，比活力為54.15 IU/mg，以戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化酶。酶動力學(xué)研究表明，固定化酶的最適pH為8.5，最適溫度為70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力較高；該酶的耐熱性很強(qiáng)，而固定化酶的熱穩(wěn)定性比原酶強(qiáng)；以羧甲基纖維素鈉為底物，固定化酶的Km為7.19mg/ml，Vmax為0.132mg/ml·min。
　　關(guān)鍵詞： 褐色高溫單孢菌 纖維素酶 固定化
　　一、前言
　　在化工資源貯藏量不斷減少的今天，通過可再生纖維素資源的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)葡萄糖和乙醇已成為當(dāng)前研究的熱點[1]-[2]。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，其最大的潛在用途是把纖維素類物質(zhì)酶法水解成葡萄糖。迄今為止，已有很多關(guān)于纖維素酶生產(chǎn)菌株的研究報道[3]-[4]，但其中多數(shù)以真菌如黑曲霉（Aspergillusniger）和木霉（Trichodermareesei）等為研究對象。由細(xì)菌、放線菌所產(chǎn)生的中性纖維素酶和堿性纖維素酶，在洗滌劑工業(yè)中的應(yīng)用已引起人們的高度重視[5]-[6]。有關(guān)褐色高溫單孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）產(chǎn)纖維素酶的性質(zhì)，黎海彬等[7]-[8]已做了研究，但對該酶的固定化未見有報道。本研究對發(fā)酵的粗酶液進(jìn)行了純化，再制備成固定化酶，然后對其最適反應(yīng)溫度、pH值、耐熱性及米氏常數(shù)等進(jìn)行了研究，望能為其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)等方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。
　　二、材料和方法
　　1.實驗材料
　?。?）菌種
　　褐色高溫單孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）[7]。
　?。?）試劑
　　分離介質(zhì)SephadexG-100（德國Phamacia）；羧甲基纖維素鈉（美國Sigma）；牛血清白蛋白為進(jìn)口分裝；其余均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。
　?。?）儀器
　　高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼公司）；紫外可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；核酸蛋白檢測儀、梯度儀、恒流泵、自動部分收集儀（上海滬西分析儀器廠）等。
　?。?）搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)基
　　在Hagerdal Medium[3]中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的微晶纖維素作為碳源。
　　2.實驗方法
　?。?）蛋白質(zhì)含量測定
　　采用Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量[9]，以牛血清白蛋白（BSA）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　?。?）SDS-PAGE[10]
　　采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度4%，用0.25%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G-250染色。
　?。?）殼聚糖的制備[11]-[12]
　　將蝦皮洗凈，然后去掉殘余的蝦肉，用3～4倍量體積的4%的稀鹽酸和10%的NaOH反復(fù)處理4～5次，每次8～10h，用水洗至中性。所得的白色幾丁質(zhì)加入50%的NaOH，于80℃～100℃下保溫處理6～7h后，再水洗至中性，曬干粉碎，過40目篩即得。
　?。?）粗酶的制備[8]
　　在裝有100ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的500mL三角瓶中接入10ml種子液，于55℃、200r/min下培養(yǎng)24～48h，取培養(yǎng)液以4000r/min的速度離心20min，所得上清液即為粗酶液。
　?。?）粗酶液的純化
　?、倭蛩徜@沉淀和透析。取粗酶液，加入硫酸銨至30%飽和度，在4℃，10000r/min下離心10min，收集沉淀物，再溶于少量磷酸緩沖液中，透析除鹽，制得經(jīng)硫酸銨沉淀的純化酶液。
　?、谄暇厶悄z層析。葡聚糖凝膠SephadexG-100經(jīng)充分溶脹后上柱，柱子經(jīng)0.10mol/L的pH6.0的磷酸緩沖液充分平衡后上樣，每6min收集一管，分別測定各管的纖維素酶活。
　?。?）纖維素酶的固定化[13]-[14]
　　取一定量的殼聚糖于6%的戊二醛中攪拌2.5h，4℃過夜，然后洗去殘余的戊二醛，在交聯(lián)后的殼聚糖中加入纖維素酶液，室溫下攪拌2.0h，于4℃靜置過夜，再洗去游離酶，即得固定化酶。
　?。?）纖維素酶（CMCase）活力的測定及定義[15]
　　酶活力的測定以羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）作底物，經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖，然后用DNS（二硝基水楊酸）法測定還原糖的含量，由還原糖的量來求得酶活力的大小。
　　取0.5ml適當(dāng)稀釋的酶液，與1.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%的CMC-Na溶液混合，在65℃下反應(yīng)30min，取出加入3mlDNS顯色液，然后煮沸5min，停止反應(yīng)，冷卻，于分光光度計上530nm處比色（空白試驗中除酶液事先滅活外，其余條件不變）。
　　一個酶活單位被定義為在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化底物產(chǎn)生1μmol還原糖（按葡萄糖計）所需的酶量。
　?。?）固定化酶的動力學(xué)
　　分別在不同的pH及溫度下，測定其對酶反應(yīng)速度的影響，并在不同的底物濃度下測定固定化酶的米氏常數(shù)K和V。
　　三、結(jié)果
　　1.硫酸銨沉淀
　　發(fā)酵粗酶液經(jīng)離心去除菌體和殘渣后，在其上清液中緩慢加入硫酸銨至30%的飽和度，4℃過夜，離心、去除雜蛋白。于上清液中緩慢補(bǔ)加入硫酸銨至80%飽和度，4℃過夜，離心收集沉淀，沉淀物溶于檸檬酸緩沖液中。透析檢查無銨離子后，計算其收率為65.73%。
　　2.第一次SephadexG-100柱層析
　　經(jīng)硫酸銨鹽析后的透析液加到平衡好的SephadexG-100柱上，再用同樣的緩沖液洗脫，洗脫曲線為三個峰（峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ），經(jīng)檢測主要的纖維素酶活力包括在峰Ⅲ中，但SDS-PAGE結(jié)果表明還有雜蛋白存在，其純化倍數(shù)為30.87，結(jié)果見表1。
　　3.第二次SephadexG-100柱層析
　　將第一次洗脫峰Ⅲ合并，進(jìn)行第二輪SephadexG-100柱層析，纖維素酶活都包括在峰Ⅲ中，SDS-PAGE結(jié)果表明酶的純度很高。將具有纖維素酶活的峰Ⅲ合并，測定每一步純化操作中的蛋白濃度和酶活力，計算比活力，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，經(jīng)過SephadexG-100柱純化后，酶的比活力為54.15IU/mg，提純倍數(shù)為47.50。
　　4.不同酶量對固定化酶活力的影響
　　取7份1.5g殼聚糖與戊二醛的交聯(lián)物，分別加入2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml的酶液，固定化后測定其酶活力，結(jié)果見圖1。
　　5.固定化纖維素酶的最適pH
　　取一定量的固定化酶，分別在pH為5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0下測定其酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶在pH為8.5時，酶的活力最高，如圖2所示。
　　6.固定化纖維素酶的最適溫度
　　取一定量的固定化酶，分別在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃下測定其酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶在溫度為70℃時，酶的活力最高。
　　7.固定化纖維素酶的耐熱性實驗
　　取10份固定化酶和原酶，分別置于70℃的水浴中，每間隔10min取出一管，按上述方法測定其酶活力，連續(xù)進(jìn)行100min，結(jié)果如圖4所示。
　　8.固定化酶的米氏常數(shù)
　　用等量的固定化酶與不同的底物濃度于65℃下反應(yīng)15min，測定其吸收值，用雙倒數(shù)作圖法作圖，測定酶的米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度，結(jié)果見表2。由雙倒數(shù)作圖可知，以CMC-Na為底物，固定化纖維素酶的Km為7.19mg/ml，Vmax為0.132mg/ml·min，而原酶液的Km為7.27mg/ml。
　　四、討論
　　圖1結(jié)果表明，隨著加入酶量的增加，其酶活力隨著增大，但當(dāng)加入的酶量增加到一定程度時，酶活力增加變得緩慢，這可能是由于在酶的固定化過程中，一定量交聯(lián)后的載體，其活性基團(tuán)是一定的，結(jié)合位點未被飽和之前，固定化酶的活力會隨加入酶量的增加而增大，一旦結(jié)合位點被飽和后，再增加加入的酶量卻不能增加酶活力。
　　如圖2所示，原酶的最適pH值為9.0，可能由于殼聚糖是陽離子型載體，因而固定化酶的最適pH值比原酶要低。
　　如圖3所示，而且固定化酶的熱穩(wěn)定性較原酶高，在60℃～80℃時酶活力都較高。這表明纖維素酶經(jīng)固定化后，對熱的穩(wěn)定性明顯提高。
　　圖4的結(jié)果表明，褐色高溫單孢菌纖維素酶的耐熱性很強(qiáng)，保溫100min后，固定化酶的酶活基本保持不變，而且固定化酶比原酶具有較高的熱穩(wěn)定性，由此可以看出，固定化酶的適應(yīng)性更強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)等各個方面。
　　表2結(jié)果表明該纖維素酶在固定化后，其米氏常數(shù)略有減小，說明纖維素酶經(jīng)固定化后，與底物的親和力有所增加。
　　五、結(jié)語
　　褐色高溫單孢菌PE-211纖維素酶經(jīng)硫酸銨鹽析和SephadexG-100柱純化后，粗酶液被純化47.5倍，比活力為54.15IU/mg。酶動力學(xué)研究表明，固定化酶的最適pH為8.5，最適溫度為70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力較高；該酶的耐熱性強(qiáng)，而固定化酶的熱穩(wěn)定性比原酶強(qiáng)；以羧甲基纖維素鈉為底物，固定化酶的K為7.19mg/ml，V為0.132mg/ml·min。
　　有關(guān)褐色高溫單孢菌PE-211固定化纖維素酶在解決能源危機(jī)及可再生資源利用等方面有待進(jìn)一步研究。
　　參考文獻(xiàn)：
　　[1]Ghose T K.Bioconversion of cellulosic substances into chemicals，energy and microbial protein[M].New Delhi：IIT，1978.
　　[2]黎海彬，郭寶江.酶工程的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工，2006.
　　[3]Hagerdal B，Harris H，Pye E K.Saccharifications of cellulose using the cellulases from the mesophile Trichoderma reesei[J].Biotechnol Bioengineer，1979.
　　[4]Kim S W，Kang S W，Lee J S.Cellulas and xylanas production by Aspergillus niger KKS in various bioreactors[J].Bioresource technology， 1997.
　　[5]穆小民，吳顯榮.酶的開發(fā)利用與酶工程[J].生物技術(shù)，1995.
　　[6]宋波，鄧曉皋，施雷霆.纖維素酶的研究進(jìn)展[J].上海環(huán)境科學(xué)，2003.
　　[7]黎海彬，李琳，黃日波，郭祀遠(yuǎn)，蔡妙顏.纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究[J].華南理工大學(xué)學(xué)報，2003.
　　[8]黎海彬，黃日波，韋小英.褐色高溫單胞菌PE-211產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)特性研究[J].廣西大學(xué)學(xué)報，2004.
　　[9]李建武，蕭能庚，余瑞元等.生物化學(xué)實驗原理和方法[M].北京：北京大學(xué)出版社，1994.
　　[10]徐際升.蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺電泳中的一些染色方法[J].生命的化學(xué)，1988.
　　[11]陳盛，黃智，劉艷如.殼聚糖固定化纖維素酶的研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996.
　　[12]戴云，董學(xué)暢，馬新華.從蟬殼制備殼聚糖[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1999.
　　[13]王柏臣，劉波.可溶性殼聚糖對纖維酶的抑制作用[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2002.
　　[14]朱啟忠，殼聚糖固定化半纖維素酶的研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000.
　　[15]劉妙蓮，王潔.影響纖維素酶活力測定的幾個因素[J].食品與發(fā)酵工程，2000.
　　[16]朱啟忠，韓曉弟，張法忠等.鏈霉菌Strz-6木聚糖酶的純化和固定化[J].工業(yè)微生物，200