張 靜 張 靜 李勝蘭 吳 媛 安 威

（首都醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué) 肝臟保護(hù)與再生北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100069）

肝臟是人體非常重要的器官，在體內(nèi)發(fā)揮著消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒、代謝等重要功能。正因如此，肝臟也同樣容易受到各種毒素的損傷。肝刺激因子（hepatic stimulator substance，HSS）［1］是從新生大鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)并提取出的一種活性物質(zhì)，可以特異性刺激活化狀態(tài)下肝細(xì)胞（如新生動(dòng)物肝臟，肝部分切除，肝毒物損傷）的增殖［2，3］。在肝大部分切除術(shù)后的小鼠中，HSS也作為肝臟再生與修復(fù)的標(biāo)志之一［4］。有文獻(xiàn)表明，HSS對于靜息狀態(tài)下的肝細(xì)胞沒有刺激作用，但是當(dāng)它與EGF（或HGF）等生長因子聯(lián)合使用時(shí)，則可明顯增強(qiáng)生長因子的作用［5］?；贖SS可放大生長因子的作用效果，故將HSS命名為肝再生增強(qiáng)因子（augmenter of liver regeneration，ALR）［6］。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)［7］，將 CCl4從小鼠尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，造成小鼠肝臟的損傷與纖維化時(shí)，ALR基因治療可以抵抗這種損傷，包括降低線粒體功能障礙，抑制氧化應(yīng)激，阻止肝星狀細(xì)胞活化等。線粒體不僅是真核細(xì)胞的能量工廠，更參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程，許多研究表明，當(dāng)機(jī)體處于病理或非正常狀態(tài)下時(shí)，線粒體可作為細(xì)胞凋亡的感受器或放大器，對細(xì)胞生存起調(diào)節(jié)作用，又被稱作細(xì)胞的“生死開關(guān)”［8，9］。因此，基于 HSS對細(xì)胞保護(hù)的作用，又與抗凋亡密切相關(guān)，但機(jī)制尚未清楚，本文將重點(diǎn)放在ALR與線粒體上，旨在觀察ALR在亞細(xì)胞中的定位，對線粒體膜電勢、功能以及形態(tài)的影響，為下一步探討保護(hù)機(jī)制提供前期的必要條件。

材料和方法

1.主要試劑

BEL－7402：人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系，本室保存；Alexa Fluor 488羊抗小鼠IgG（H＋L）（美國Invitrogen公司）；ATP檢測試劑盒（美國Promega公司）；羰基氰化間氯苯腙CCCP（carbonyl cyanide m－chlorophenylhydrazone）（美 國 Sigma 公 司 ）；DMEM （Dulbecco＇s modified Eagle medium）培養(yǎng)基（美國 GIBCO／BRL公司）；DiIC1（5）流式細(xì)胞檢測試劑盒、Mito Tracker 580染劑（美國 Molecular Probes公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

野生型BEL－7402細(xì)胞（人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系）、600μg G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體BEL－7402／FLAG－pcDNA 3.0 或 FLAG－pcDNA 3.0／h HSS基因的BEL－7402單克隆細(xì)胞系，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24－48 h傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.免疫熒光（immunofluorescence，IF）

將直徑為12 mm，厚0.1 mm的蓋玻片放入24孔板，將野生型、轉(zhuǎn)染空載體或HSS基因的BEL－7402細(xì)胞按2.5×105／孔接種到24孔板中，24 h后細(xì)胞貼壁于玻片上形成細(xì)胞爬片；向孔內(nèi)加入終濃度200 nmol／L的Mito Tracker 580染劑，使線粒體染色，4%多聚甲醛固定后孵育anti－Flag抗體，4℃過夜；Alexa Flour 488羊抗小鼠IgG（H＋L）熒光二抗，于室溫避光平緩搖動(dòng)1h；Hoechst染液（終濃度5μg／ml），將細(xì)胞核染色。用小鑷子取出細(xì)胞爬片，倒扣于載破片上，50%甘油封片；激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

4.線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

將野生型7402細(xì)胞、對照組轉(zhuǎn)染空載體的7402細(xì)胞以及實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染HSS的7402細(xì)胞按2.5×106個(gè)接種到直徑100 mm的培養(yǎng)皿中，待貼壁后，用15μmol／L CCCP損傷24h，將細(xì)胞用胰酶消化，懸浮于PBS收集在1.5 ml EP中，離心后細(xì)胞融合成團(tuán)，用3%戊二醛固定3h，PBS洗滌細(xì)胞三次，送電鏡室包埋，電鏡透射照片。

5.線粒體膜電勢（MMP）測定

DiIC1（5）是一種氰化物，可以特異測量線粒體膜電勢，當(dāng)膜電勢變化時(shí)，染劑在線粒體的積聚濃度會(huì)發(fā)生變化。細(xì)胞用胰酶消化并用PBS懸浮后，加入CCCP（終濃度50μmol／L），37℃作用5min，加入DiIC1（5）使其終濃度為50 nmol／L，之后在37℃度孵箱孵育30min，PBS洗滌細(xì)胞兩次后，用流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電勢。

6.ATP檢測

將野生型7402細(xì)胞、對照組轉(zhuǎn)染空載體的7402細(xì)胞以及實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染HSS的7402細(xì)胞按2.5×104／孔接種到 96 孔板中，7.5μmol／L CCCP 37℃作用12h；棄去96孔板中的培養(yǎng)基，加入100 μl新鮮培養(yǎng)基，置于室溫平衡30 min；加入100μl的ATP檢測試劑盒中附帶裂解Buffer，之后充分混勻，避光靜置10 min；離心（1，500×g，2min）；將96孔培養(yǎng)板中的樣品轉(zhuǎn)移至96孔白光板（200μl／孔）；立即在微孔板化學(xué)發(fā)光光度儀（luminant microplate reader）檢測發(fā)光值，記錄相對發(fā)光強(qiáng)度（每個(gè)樣品三孔平行）；以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)樣品做陰性和陽性對照。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.HSS主要定位于線粒體

如圖1所示，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核，紅色熒光代表線粒體，綠色熒光代表轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的HSS。圖中所見：在轉(zhuǎn)染空載體的7402細(xì)胞中，只有紅色熒光線粒體而沒有綠色熒光HSS的表達(dá)；在轉(zhuǎn)染FLAG－pcDNA 3.0／h HSS基因 的 BEL－7402 細(xì) 胞中，既有紅色熒光線粒體又有綠色熒光HSS的表達(dá)，將圖像重疊后，紅色熒光和綠色熒光幾乎完全疊加呈黃色熒光，說明轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的HSS主要定位于線粒體。

圖1 轉(zhuǎn)染的HSS在BEL－7402細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及定位的激光共聚焦顯微鏡觀察。vector－Tr，轉(zhuǎn)染空載體的BEL－7402細(xì)胞；HSS－Tr，轉(zhuǎn)染 HSS基因的BEL－7402細(xì)胞。Fig.1 Confocal microscopic observation of expression and localization of h HSS transfected BEL－7402 cells.vector－Tr，transfected with vector in BEL－7402；HSS－Tr，transfected with h HSS in BEL－7402.

2.HSS對線粒體的形態(tài)起維持作用

如圖2所示，圖A為正常的野生型7402細(xì)胞，正常的線粒體富含嵴，具有典型的雙層膜結(jié)構(gòu)。B、C、D圖顯示為CCCP損傷后野生組、空載體組以及實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染HSS的7402細(xì)胞。從圖中可以看出，野生組及空載體組在受到線粒體特異性膜孔道開放劑CCCP損傷后，線粒體數(shù)量減少，體積變大，線粒體嵴消失、內(nèi)膜腫脹，而在轉(zhuǎn)染HSS的7402細(xì)胞中，線粒體數(shù)量以及體積并沒有發(fā)生明顯變化，線粒體嵴存在。由此說明HSS對于線粒體的形態(tài)起到了保護(hù)作用。

圖2 HSS對線粒體超微結(jié)構(gòu)保護(hù)作用的電鏡觀察。A，野生型BEL－7402細(xì)胞；B，CCCP損傷后的BEL－7402細(xì)胞；C，CCCP損傷后的轉(zhuǎn)染空載體的BEL－7402細(xì)胞；D，CCCP損傷后轉(zhuǎn)染HSS的BEL－7402細(xì)胞。Fig.2 Electron microsopic observation on HSS protecting morphology of mitochondria.A，wild－type of BEL－7402；B，BEL－7402 plus CCCP；C，vector－transfected BEL－7402 plus CCCP；D，h HSS－transfected BEL－7402 plus CCCP

3.HSS可以穩(wěn)定線粒體膜電勢

CCCP可誘導(dǎo)線粒體膜孔道開放，導(dǎo)致大量線粒體內(nèi)容物外流，線粒體膜電位（MMP）降低或喪失，用DiIC（5）測定MMP顯示其熒光強(qiáng)度降低，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果可見峰值左移。圖3A是野生組、空載體組以及轉(zhuǎn)染HSS基因的肝細(xì)胞，CCCP處理樣本（藍(lán)色峰）與對照樣本（紅色峰）的疊加圖，可見CCCP損傷細(xì)胞后，野生組及空載體組的熒光強(qiáng)度峰值左移幅度較大，表明MMP下降明顯，而轉(zhuǎn)染HSS基因的肝細(xì)胞其MMP受CCCP的影響較小，圖3B為相對熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果，CCCP作用下，野生型及轉(zhuǎn)染空載體的肝細(xì)胞MMP較未處理組降低了61%和59%，而轉(zhuǎn)染HSS基因的肝細(xì)胞MMP的下降幅度較?。?8%），說明HSS具有穩(wěn)定MMP的作用。

圖3 CCCP對線粒體膜電勢的影響。A，線粒體膜電勢峰圖。紅色峰是對照樣本，藍(lán)色峰是CCCP損傷樣本。vector－Tr表示轉(zhuǎn)染空載體BEL－7402細(xì)胞，HSS－Tr表示轉(zhuǎn)染HSS的BEL－7402細(xì)胞。B，相對熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果。＊P＜0.05Fig.3 The effect of CCCP on MMP.A，Histogram of MMP.Red line stands for control samples，blue line stands for CCCP injured samples.vector－Tr，transfected with vector in BEL－7402；HSS－Tr，transfected with h HSS in BEL－7402.B，relative fluoresence intensity.＊P＜0.05

4.HSS抑制細(xì)胞中ATP的下降

為了觀察CCCP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，線粒體的能量產(chǎn)生狀況，用熒光素酶法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。如圖4所示，當(dāng)用CCCP分別損傷野生組、對照組以及轉(zhuǎn)染HSS組的7402細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ATP水平顯著下降，但過表達(dá)HSS組ATP的含量比野生組及空載體組細(xì)胞多約30%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明HSS對細(xì)胞內(nèi)ATP的貯存起重要的維護(hù)作用。

圖4 細(xì)胞內(nèi)ATP水平.＊P＜0.05Fig.4 Intracellular ATP level.＊P＜0.05

討 論

線粒體為雙層膜結(jié)構(gòu)包裹的細(xì)胞器［10］，而線粒體內(nèi)膜對離子、小分子物質(zhì)的通透性有嚴(yán)格的選擇性，由于屏障結(jié)構(gòu)的存在，使內(nèi)膜兩側(cè)形成電勢差，即線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP），膜電位的形成為氧化磷酸化實(shí)行提供必要條件［11］，這對于線粒體結(jié)構(gòu)和功能有重要意義。換言之，線粒體的功能依賴于線粒體兩側(cè)膜電勢的維持。當(dāng)?shù)蛲鲆蜃幼饔糜跈C(jī)體，線粒體內(nèi)膜非特異性孔道產(chǎn)生，細(xì)胞色素c從內(nèi)膜脫落并流失到胞質(zhì)中，Bax表達(dá)，半胱天冬酶（caspase）活化等現(xiàn)象，這些都是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的因素，Bcl－2、Bcl－XL等分子的表達(dá)則可以抑制線粒體活性氧的生成和阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生［12，25］。線粒體膜孔道復(fù)合體（mitochondrial permeabilization transition pore，MPTP）位于線粒體內(nèi)、外膜之間，是由許多蛋白所組成的復(fù)合孔。其中主要的是這三種蛋白：外膜的電位依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channel，VDAC），內(nèi)膜的腺苷酸轉(zhuǎn)位酶（adenine nucleotide translocase，ANT），以及基質(zhì)的親環(huán)蛋白D（cyplophilin D，Cyp－D）。生理狀態(tài)下 MPTP的周期性開放，防止外室正離子過度蓄積，以維持線粒體內(nèi)電化學(xué)平衡態(tài)，保持氧化還原通路通暢。當(dāng)膜孔道過度開放，則會(huì)導(dǎo)致膜電勢持續(xù)下降，發(fā)生線粒體膜電勢轉(zhuǎn)換（mitochondrial permeability transition，MPT），線粒體內(nèi)物質(zhì)流出，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡［13－15］。由于孔道對小于15 KD的大分子均可通過，H2O及小分子將到達(dá)基質(zhì)，導(dǎo)致基質(zhì)膨脹而使線粒體內(nèi)膜嵴被拉直，外膜破裂，如果這種線粒體數(shù)量增加，在胞質(zhì)中釋放出的可溶性蛋白濃度達(dá)到一定閾值，就會(huì)啟動(dòng)核凋亡的產(chǎn)生［16］，有報(bào)道指出，MPTP與電控離子通道上的VDAC相關(guān)，其開放是凋亡的早期事件［17］。所以，穩(wěn)定MMP，抑制MPTP的發(fā)生，可以在一定程度上防止凋亡的發(fā)生，從而保護(hù)細(xì)胞免受毒素的影響。有報(bào)導(dǎo)稱［18］，ALR與氧化呼吸鏈也有密切聯(lián)系，以二硫蘇糖醇（DTT）為還原底物，細(xì)胞色素C作為HSS的電子受體催化速率是氧的100倍。不僅如此，在體內(nèi)的研究中，也有文獻(xiàn)報(bào)道ALR可以保護(hù)小鼠肝臟免受CCl4、氨基半乳糖等毒物肝臟的特異性損害［19－21］。此外，ALR能夠增加線粒體基因的表達(dá)，增加細(xì)胞色素c的含量，也能增強(qiáng)肝臟線粒體的氧化磷酸化活性［22］。ALR和氧化還原調(diào)節(jié)受體——Mia40／Tim40都是二硫化物轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的成員，即均可介導(dǎo)多種蛋白質(zhì)定向轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入線粒體的膜間隙［23，24］。在肝臟修復(fù)過程中，充足的Fe／S蛋白是有利于受損細(xì)胞的修復(fù)。

從我們研究的數(shù)據(jù)看，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中的肝刺激因子大部分定位于線粒體，少部分定位于胞漿及胞核。羰基氰化間氯苯腙（carbonyl cyanide m－chlorophenylhydrazone，CCCP）能造成線粒體膜孔道通透性瞬間開放，使線粒體通透性轉(zhuǎn)換（mitochondrial permeability transition，MPT），MMP降低，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)用CCCP分別損傷野生組BEL－7402細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體的BEL－7402細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染HSS的BEL－7402細(xì)胞后，在形態(tài)學(xué)方面，HSS可以維持線粒體的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)，沒有發(fā)生野生組出現(xiàn)的線粒體腫脹現(xiàn)象；在功能方面，HSS可以維持細(xì)胞內(nèi)ATP水平；在穩(wěn)定膜電勢方面，作用突出。由此表明，肝刺激因子在細(xì)胞中主要定位于線粒體，保護(hù)肝細(xì)胞免受毒素?fù)p傷與維持線粒體膜電勢（MMP）密切相關(guān)。

［1］LaBrecque DR，Pesch LA.Preparation and partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance（SS）from rat liver.Physiol，1975，248：273－284

［2］Terblanche J，Porter KA，Starzl TE，et al.Stimulation of hepatic regeneration after partial hepatectomy by infusion of a cytosol extract from regenerating dog liver.Surg.Gynecol.Obstet，1980，151：538－544

［3］LaBrecque DR，Steele G，F(xiàn)ogerty S，et al.Purification and physical－chemical characterization of hepatic stimulator substance.Hepatology，1987，7：100－106

［4］Polimeno L，Pesetti B，Annoscia E，et al.Alrp，a survival factor that controls the apoptotic process of regenerating liver after partial hepatectomy in rats.Free Radic Res，2011，45（5）：534－549

［5］Liu X，Kim CN，Yang J，et al.Induction of apoptotic program in cell－free extracts：requirement for d ATP and cytochrome c.Cell，1996，86（1）：147－157

［6］Shi Y.Apoptosome：the cellular engine for the activation of caspase－9.Structure，2002，10（3）：285－288

［7］Song M，Yi X，Chen W，et al.Augmenter of liver regeneration（ALR）gene therapy attenuates CCl－induced liver injury and fibrosis in rats.Biochem Biophys Res Commun，2011，415（1）：152－156

［8］Green DR，Reed JC.Mitochondria and apoptosis.Science，1998，281（4）：1309－1312

［9］Lenaz G.Role of mitochondria in oxidative stress and ageing.Biochim Biophys Acta，1998，1366（1）：52－67

［10］Marchetti P，Hirsch T，Zamzami N，et al.Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis.J Immunol，1996，157（11）：4830－4836

［11］Marchetti P，Castedo M，Susin SA，et al.Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis.J Exp Med，1996，184（3）：1155－1160

［12］Skulachev VP.Role of uncoupled and non－coupled oxidations in maintenance of safely low levels of oxygen and its one－electron reductants.Quart Re V Biophys，1996，29（1）：169－202

［13］胡鍇，劉好朋，萬婷等.線粒體與細(xì)胞凋亡的關(guān)系.生物技術(shù)，2010，37（12）：86－88

［14］張雪嬌，鄭仕中，陸茵等.線粒體在肝細(xì)胞凋亡中的作用及中藥對其保護(hù)作用.中草藥，2011，42（7）：1441－1445

［15］Chen W，Zhao Z，Li L，et al.Hispolon induces apoptosis in human gastric cancer cells through a ROS－mediated mitochondrial pathway.Free Radical Bio Med，2008，45（1）：60－72

［16］Karbowski M，Kurono C，Wozniak M，et al.Free radical－induced megamitochondria formation and apoptosis.Free Radic Biol Med，1999，26（1／2）：396－409

［17］Yoshida H，Kong YY，Yoshida R，et al.Apaf1 is required for mitochondria pathways of apoptosis and brain development.Cell，1998，94（6）：739－750

［18］Du C，F(xiàn)ang M，Li Y，et al.Smac，a mitochondrial protein that pro－motes cytochrome c－dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition.Cell，2000，102（1）：33－42

［19］Mei MH，An W，Zhang BH，et al.Hepatic stimulator substance protects against acute liver failure induced by carbon tetrachloride poisoning in mice.Hepatology，1993，17（4）：638－644

［20］Yao ZQ，Yang WS，Zhang WB，et al.Human hepatic regenerative stimulator substance：partial purification and biological characterization of hepatic stimulator substance from human fetal liver cells.Hepatology，1990，12（5）：1144－1151

［21］Jiang B，Sawa M，Yamamoto T，et al.Enhancement of proliferation of intrasplenically transplanted hepatocytes in cirrhotic rats by hepatic stimulatory substance.Transplantation，1997，63（1）：131－135

［22］Penninger JM，Kroemer G.Mitochondria，AIF，and capases－rivaling for cell death execution.Exp Cell Res，2003，5（2）：97－99

［23］Gregan SP，Dawson VL，Slack RS.Role of AIF in caspase－dependent and caspase－independent cell death.Oncogene，2004，23（16）：2785－2796

［24］Verhagen AM，Ekert PG，Pakusch M，et al.Identification of DIABLO，a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins.Cell，2000，102（1）：43－53

［25］Baines CP，Kaiser RA，Purcel NHL，et al.Loss of cyclophilin D reveals a critical role for mitochondrial permeability transition in cell death.Nature，2005，434（7033）：658－662