池闖， 劉瑜， 林曉銘， 孫成超

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325000）

晝夜節(jié)律生物鐘普遍存在于生物界，機(jī)體的生理、生化、行為過程中都表現(xiàn)出一定的晝夜節(jié)律變化，晝夜節(jié)律生物鐘的紊亂可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。流行病學(xué)研究[1-2]表明，長(zhǎng)期夜班女性患乳腺癌的概率明顯高于正常上班人群，而長(zhǎng)期夜班男性人群易患前列腺癌。Per2作為生物鐘基因中的關(guān)鍵組成部分，亦可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[3-4]惡性腫瘤中均存在Per2表達(dá)的降低或缺失。我們采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）組織中Per2的表達(dá)，探討其在 NSCLC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用及其與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2005年1月到2006年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科手術(shù)治療的NSCLC病例60例，其中男38例，女22例，年齡38～77歲，≤60歲的27例，＞60歲的33例。有吸煙史37例，無吸煙史23例；中央型24例，周圍型36例；鱗癌28例，腺癌32例；高、中分化34例，低分化26例；I期14例，II期28例，III期18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。另選取同期肺大皰及肺囊腫手術(shù)中切除的正常肺組織共20例作為對(duì)照。隨訪日期以患者手術(shù)日起計(jì)算，截至2009年12月或患者死亡日期。

1.2 方法 鼠抗人Per2（M01）單克隆抗體購(gòu)自ABNOVA公司；免疫組織化學(xué)SP試劑盒及其他試劑

均購(gòu)自北京中杉金橋公司。組織蠟塊4μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，無水乙醇逐步水化，抗原修復(fù)，SP法免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照。Per2染色以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性。高倍鏡下隨機(jī)選10個(gè)視野，各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。細(xì)胞無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。上述兩分值相乘≥2分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)；單因素分析采用Kaplan-Meier法并繪制累積生存曲線，用Log-rank檢驗(yàn)；多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Per2在NSCLC組織和正常肺組織中的表達(dá)情況 正常肺組織中Per2的陽性表達(dá)率為95.0%（19/20），而NSCLC組織中Per2的陽性表達(dá)率為71.7%（43/60），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。2.2 Per2的表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 Per2的陰性表達(dá)與NSCLC的分化程度及TMN分期相關(guān)（P＜0.05，見表1），而與性別、年齡、是否吸煙、病理類型、大體分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o相關(guān)性（P＞0.05）。

表1 Per2在NSCLC中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 NSCLC患者預(yù)后的單因素分析 本組60例NSCLC患者中，1年生存率為83.3%，2年生存率為63.3%，3年生存率為53.3%。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素分析表明患者的術(shù)后3年生存率與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Per2的表達(dá)狀態(tài)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，Per2生存曲線見圖1）；而與性別、年齡、是否吸煙、病理類型、大體分型等因素?zé)o相關(guān)性（P＞0.05）。

圖1 Per2表達(dá)的NSCLC的生存曲線

2.4 NSCLC患者預(yù)后的多因素分析 將經(jīng)過單因素分析篩選出來的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Per2的表達(dá)狀態(tài)四項(xiàng)臨床病理指標(biāo)納入COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型，進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示隨著NSCLC分化程度的降低、TNM分期的進(jìn)展、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、Per2的陰性表達(dá)，患者死于肺癌的相對(duì)危險(xiǎn)度增加，但四者均非影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＞0.05）。見表2。

表2 NSCLC預(yù)后的多因素分析結(jié)果

3 討論

晝夜節(jié)律生物鐘是由一組呈節(jié)律表達(dá)的生物鐘基因及其相關(guān)蛋白產(chǎn)物作為特異核心元件組成的。哺乳動(dòng)物的生物鐘基因最早發(fā)現(xiàn)于下丘腦視交叉上核（SCN）中，以后又逐步發(fā)現(xiàn)其在外周組織中也有表達(dá)，包括CKIε、Clock、Per1、Per2、Per3，Bmal 1、dbp、Rev-Erbα和Cryl、Cry2。其基本分子機(jī)制就是生物鐘基因及其蛋白產(chǎn)物構(gòu)成的自主調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄—翻譯負(fù)反饋回路，從而形成體內(nèi)精準(zhǔn)的24 h生物鐘。Per2不但在晝夜節(jié)律的產(chǎn)生和維持中起著重要作用，而且在腫瘤抑制和體內(nèi)DNA損傷反應(yīng)中起重要作用。Fu等[5]研究發(fā)現(xiàn)Per2突變的小鼠與野生型小鼠相比，發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。王雅平等[6]通過免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)人結(jié)直腸癌中Per2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Per2在人結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，且與結(jié)直腸癌患者年齡、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期相關(guān)。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常肺組織和NSCLC組織中均有Per2的表達(dá)，但在NSCLC組織中Per2的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；同時(shí)，Per2在NSCLC中的表達(dá)和腫瘤分化程度及TMN分期相關(guān)（P＜0.05），即腫瘤的分化程度越低，TNM分期越晚，Per2基因蛋白陽性表達(dá)率也愈低，提示生物鐘基因Per2的陰性表達(dá)與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展具有密切的關(guān)系。

通過病理類型和臨床分期預(yù)測(cè)NSCLC的生存期效果并不理想，因此尋找一些與肺癌有關(guān)的分子標(biāo)記物作為預(yù)后指標(biāo)對(duì)于完善肺癌的多學(xué)科綜合治療，提高療效具有重要意義。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、PTEN等因子[7]對(duì)NSCLC預(yù)后評(píng)估的作用已被大量實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，而關(guān)于Per2對(duì)于腫瘤預(yù)后的價(jià)值研究尚少。Per2的抗腫瘤作用主要通過調(diào)控原癌基因、抑癌基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期有關(guān)基因的時(shí)間性表達(dá)，抑制VEGF激動(dòng)劑的活性等方式進(jìn)行，其表達(dá)的下調(diào)或缺失必然會(huì)使相關(guān)的腫瘤基因失去調(diào)控而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，影響腫瘤的預(yù)后。Filipski等[8]研究表明生物鐘基因Per2 mRNA表達(dá)被抑制后，可導(dǎo)致p53表達(dá)的下調(diào)和c-myc的過表達(dá)，這兩個(gè)作用都可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Yang等[9]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Per2表達(dá)會(huì)提高CyclinD、CyclinE的表達(dá)水平，使乳腺腫瘤的生長(zhǎng)加速，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)節(jié)奏的日振幅量成倍增加。而Per2過表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率[10]。由此可見，Per2的表達(dá)狀態(tài)可能成為腫瘤預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。Oshima等[11]通過檢測(cè)結(jié)腸癌患者生物鐘基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Per2的表達(dá)降低可能是結(jié)腸癌預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子。Relles等[3]研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中Per2的低表達(dá)和患者的預(yù)后顯著相關(guān)，縮短患者生存時(shí)間。本研究在生存分析中通過單因素分析發(fā)現(xiàn)Per2的表達(dá)狀態(tài)是影響NSCLC術(shù)后3年生存率的因素（P＜0.05），Per2陰性表達(dá)患者的3年生存率明顯低于Per2陽性表達(dá)患者，我們認(rèn)為Per2和NSCLC預(yù)后關(guān)系密切，在臨床上可以把Per2作為判斷NSCLC生物學(xué)行為及預(yù)后的一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。然而在多因素分析中我們發(fā)現(xiàn)Per2陰性表達(dá)的患者死于肺癌的相對(duì)危險(xiǎn)度增加，但它不是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說明NSCLC的預(yù)后狀況是多種因素共同作用的結(jié)果，如果將Per2和其相關(guān)因子進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)可能能更好地揭示NSCLC的預(yù)后。同時(shí)通過檢測(cè)NSCLC中Per2的表達(dá)也有助于進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平研究其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制，從而為肺癌的生物治療和基因治療提供新的思路。

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