陳丹，黃飛飛，曹杰，黃少宇，章夢奇，譚峰

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.第一臨床學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

弓形蟲?。╰oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的、嚴(yán)重危害宿主健康的人獸共患寄生蟲病。人們常因生食或半生食含有弓形蟲包囊的動(dòng)物肉類而感染。

目前，微波爐已成為人們生活中的常用家用電器。研究證實(shí)，家用微波爐可有效地殺滅白色念珠菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌等一些病原體[1-2]。因此，本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)過不同功率、不同時(shí)間微波處理后的弓形蟲PRU株包囊灌飼小鼠，并對感染小鼠從SAG1-PCR、抗弓形蟲IgG抗體效價(jià)檢測與腦組織包囊計(jì)數(shù)三方面來評價(jià)經(jīng)微波處理后的包囊是否仍具有感染性，探尋利用微波爐殺滅弓形蟲包囊的最佳條件，為家庭預(yù)防弓形蟲病提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 弓形蟲蟲株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 弓形蟲成囊株P(guān)RU株由本實(shí)驗(yàn)室于小鼠體內(nèi)常規(guī)保種。ICR小鼠，雌性，18～22 g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 引物與試劑 根據(jù)弓形蟲SAG1參考核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成引物，上游引物：5’-GCTGTAACATTGA GCTCCTTGATTCCTG-3’，下游引物：5’-CCGGAACAGTACT GATTGTTGTCTTGAG-3’，擴(kuò)增片段長度為355 bp。格蘭仕微波爐（型號：wd900sl23-2；額定頻率：2450 MHz；額定輸出功率：900 W；額定輸入功率：1400 W）；弓形蟲抗體（Tox-IgG）ELISA檢測試劑盒購于珠海海泰生物制藥有限公司；DNA提取試劑盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0）為Takara公司產(chǎn)品；PCR引物由Invitrogen公司合成；PCR檢測試劑盒為TianGen公司產(chǎn)品。

1.3 包囊收集 感染弓形蟲PRU株包囊的小鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死，取腦組織勻漿，計(jì)數(shù)包囊總數(shù)。

1.4 微波爐處理包囊 實(shí)驗(yàn)組共分8組，按不同溫度分為高溫組、中溫組與低溫組，其中高溫組分為30 s與1 min 2個(gè)處理組；中溫組分為1 min、3 min與5 min 3個(gè)處理組；低溫組分為1 min、5 min與10 min 3個(gè)處理組。將腦組織勻漿液分為8份，以0.9%氯化鈉溶液調(diào)整至250個(gè)包囊/（8 mL·份），按上述不同溫度、不同時(shí)間微波處理包囊。

1.5 動(dòng)物感染 50只ICR小鼠隨機(jī)分成10組，5只/組，將上述微波處理后的包囊按50個(gè)/只灌飼小鼠。以未經(jīng)微波爐處理組作為未處理組（陽性對照組），陰性對照組只灌飼同等體積的0.9%氯化鈉溶液。灌飼當(dāng)天作為第0天，記錄各組小鼠的存活時(shí)間。42 d后對存活小鼠進(jìn)行以下評價(jià)實(shí)驗(yàn)。

1.6 評價(jià)實(shí)驗(yàn)

1.6.1 ELISA法檢測：42 d后，對存活小鼠眼眶取血，分離血清，按照Tox-IgG-ELISA檢測試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中IgG抗體效價(jià)。

1.6.2 包囊計(jì)數(shù)：取血后將小鼠脫頸處死，制備腦組織勻漿，于低倍鏡下計(jì)數(shù)包囊總數(shù)。

1.6.3 PCR檢測：將各處理組與未處理組各取1 mL腦組織勻漿，按DNA提取試劑盒說明提取DNA。PCR反應(yīng)體系：引物、dNTP、2×Master Mix?？傮w積為10μL，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。以直接提取的PRU株包囊DNA作為陽性對照。將5份陰性對照組DNA合成1份作為PCR的陰性對照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組抗體效價(jià)差異比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠存活狀況 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，低溫1 min組有2只小鼠死亡，分別死于感染后第13天和第39天；低溫10 min組有1只小鼠死于感染后第11天；未處理組有1只小鼠死于感染后第5天；其余小鼠感染后均未死亡，統(tǒng)一于感染后第42天處死。

2.2 腦組織內(nèi)包囊計(jì)數(shù) 低溫1 min組小鼠腦組織包囊總數(shù)為（655.56±363.79）個(gè)/只，未處理組小鼠腦組織包囊數(shù)為（833.33±274.03）個(gè)/只，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其余各組存活小鼠腦組織內(nèi)均未檢出包囊。

2.3 血清IgG抗體水平 低溫1 min組小鼠血清IgG抗體A450值為1.18±0.23，未處理組小鼠血清IgG抗體A450值為0.86±0.22，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其余各組ELISA法檢測結(jié)果均為陰性。2.4 SAG1-PCR結(jié)果 低溫組中只有低溫1 min處理組所有3個(gè)樣本中均檢測出弓形蟲SAG1基因，其余各組基因檢測均為陰性（見圖1）。而中溫各組（見圖2）、高溫各組（見圖3）都有部分樣本擴(kuò)增出弓形蟲SAG1基因。

圖1 低溫組弓形蟲SAG1基因檢測結(jié)果

圖2 中溫組弓形蟲SAG1基因檢測結(jié)果

圖3 高溫組弓形蟲SAG1基因檢測結(jié)果

3 討論

弓形蟲病已成為人類第二大重要食源性疾病[3]。有研究證明，食入夾生肉不僅可引起弓形蟲病的暴發(fā)[4]，同時(shí)也是孕婦感染弓形蟲最可能的原因[5-7]。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)有效的弓形蟲藥物和疫苗，故切斷傳播途徑顯得尤為重要。許多研究已證實(shí)微波爐能有效殺滅一些寄生蟲、細(xì)菌等微生物。張國華等[8-9]分別利用微波爐對肉中旋毛蟲幼蟲包囊和華支睪吸蟲囊蚴進(jìn)行處理，證實(shí)微波爐對兩種病原體均有一定的殺滅作用。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)用微波爐處理弓形蟲PRU株包囊，以探索殺滅包囊的最佳條件。

弓形蟲抗體IgG和IgM是弓形蟲感染的重要血清標(biāo)志物，其中IgG抗體雖產(chǎn)生時(shí)間較晚，但持續(xù)時(shí)間長，利用ELISA法檢測抗弓形蟲IgG抗體具有較好的敏感性及特異性[10]。本實(shí)驗(yàn)ELISA法檢測結(jié)果顯示未處理組與微波爐低溫處理1 min組呈陽性，兩組血清IgG抗體A450值分別為0.86±0.22、1.18±0.23，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組均為陰性。鏡檢結(jié)果顯示未處理組與低溫1 min處理組的包囊數(shù)分別為（833.33±274.03）個(gè)/只、（655.56±363.79）個(gè)/只，且兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組均未查出包囊。通過將包囊檢查與IgG檢測結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，只有IgG效價(jià)高的組別檢測到包囊，表明低溫1 min不能殺傷弓形蟲包囊。

PCR技術(shù)作為一種新型的分子生物學(xué)方法，自誕生以來，由于它的特異性、敏感性、能在短時(shí)間內(nèi)得到大量目的片段的優(yōu)勢，使之在弓形蟲檢測應(yīng)用中得到廣泛應(yīng)用，并取得較好的檢測效果。崔平等[11]就將PCR運(yùn)用于豬弓形蟲病的檢測，其建立的方法以SAG1基因?yàn)橐镒畹湍軝z測到5個(gè)弓形蟲速殖子的DNA，且與相關(guān)的2種寄生蟲無交叉反應(yīng)，具有高度的敏感性和特異性。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)將PCR技術(shù)用于對小鼠弓形蟲包囊感染的檢測，并在檢測過程中設(shè)立了陽性對照，陰性對照和未處理對照，結(jié)果顯示低溫1 min組均擴(kuò)增出了目的基因，其結(jié)果與IgG-ELISA、包囊鏡檢結(jié)果一致，從而進(jìn)一步證實(shí)低溫處理1 min的包囊仍然具有感染性。

然而，通過PCR技術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在IgG-ELISA與包囊鏡檢結(jié)果均為陰性的高溫組、中溫組中均有部分樣本擴(kuò)增出弓形蟲SAG1基因，特別是中溫5 min組中有1份樣本呈現(xiàn)陽性，但是低溫5 min組中所有樣品的基因檢測卻是陰性。因此，目前還不能妄下斷言其他條件就可以殺滅包囊。不難看出不管是鏡檢、ELISA法還是PCR技術(shù)都有一定的局限性，但PCR技術(shù)顯然具有更高的靈敏度。故在評價(jià)食物中是否有弓形蟲感染的時(shí)候不應(yīng)僅憑某一種檢測方法來判斷，而應(yīng)當(dāng)加入基因檢測。

本實(shí)驗(yàn)基因檢測部分結(jié)果與包囊計(jì)數(shù)和ELISA法檢測結(jié)果有一定出入，故可對ELISA法檢測結(jié)果顯示陰性而PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示陽性的樣本是否仍具有感染性進(jìn)一步檢驗(yàn)。此外，由于本實(shí)驗(yàn)是將腦組織勻漿后采用固定體積（8 mL）放入微波爐進(jìn)行處理，而實(shí)際生活中大多數(shù)為肉片，若將腦組織勻漿換成感染弓形蟲的小鼠肉片更接近實(shí)際，但在實(shí)際操作中很難得到有包囊的肉片；再者，本實(shí)驗(yàn)微波處理的樣本均是常溫腦組織勻漿，與生活中冷凍肉解凍前的冰凍狀態(tài)有所不同，其微波處理想獲得相同處理效果，需要獲得更多熱量。由于市面上微波爐型號不同、功率不同、新舊不同，相同條件處理效果也必將不盡相同。另外，李榮芬等[12]證明，微波殺菌、殺死蟲體除了熱效應(yīng)外，主要還有非熱效應(yīng)—微波機(jī)制，故適當(dāng)延長微波作用時(shí)間同樣可起到殺滅包囊作用。鑒于以上，在實(shí)際生活應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整微波處理溫度和時(shí)間。

[1] 姚遠(yuǎn), 曹永獻(xiàn), 王芹, 等. 微波爐對常見病原微生物的殺滅作用[J]. 中國消毒學(xué)雜志, 2004, 21(1): 20.

[2] 潘玉欽, 宮慰, 陳寶國, 等. 微波爐殺菌效果的試驗(yàn)觀察[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 8(3): 59-60.

[3] Buzby JC, Roberts T. ERS updates U.S foodborne diseases costs for seven pathogens[J]. Food Rev, 1996, 19(3): 20-25.

[4] Choi WY, Nam HW, Kwak NH, et a1. Foodborne outbreaks of human toxoplasmosis[J]. J Infect Dis, 1997, 175(5): 1280-1282.

[5] Baril L, Ancelle T, Goulet V, et a1. Risk factors for Toxoplasma infection in pregnancy: a case-control study in France[J]. Scand J Infect Dis, 1999, 31(3): 305-309.

[6] Cook AJ, Gilbert RE, Buffolano W, et a1. Sources of Toxoplasma, infection in pregnant women: European multicentre case-control study. European Research Network on Congenital Toxoplasmosis[J]. BMJ, 2000, 321(7254):142-147.

[7] 潘長旺, 張姿英, 林蓮蓮, 等. 弓形蟲感染母嬰傳播的前瞻性研究[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1997, 27(4): 227-228.

[8] 張國華, 牛安歐, 胡昌仁. 烤肉串、微波爐對肉中旋毛蟲的殺傷作用[J]. 中國人獸共患病雜志, 1997, 13(3): 76.

[9] 張國華, 陳修文, 黃濤, 等. 微波照射對華支睪吸蟲囊蚴的殺傷作用[J]. 中國血吸蟲防治, 2002, (6): 435.

[10] 陳飛蘭, 艾必燕. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲ELISA檢測方法建立及應(yīng)用[J]. 重慶中草藥研究, 2002, 6(1): 45-46.

[11] 崔平, 劉洪彬, 方素芳, 等. PCR檢測豬弓形蟲病方法的建立[J]. 中國動(dòng)物檢疫, 2009, 26(5): 62-63.

[12] 李榮芬. 微波的殺菌機(jī)理[J]. 中國消毒學(xué)雜志, 1992, 9(4): 243-248.