楊森，南存金，木海琦，王怡君，蘇紅俠，陳映鶴

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325027）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其中70%為淺表性膀胱癌。手術(shù)是淺表性膀胱癌治療的主要手段，但是術(shù)后復發(fā)率高，嚴重影響了患者術(shù)后的生存率[1-2]。目前臨床廣泛采用吡柔比星等藥物行膀胱內(nèi)灌注化療，對預防淺表性膀胱癌術(shù)后復發(fā)具有一定的療效[3]。隨著細胞免疫治療在臨床上的開展，以樹突狀細胞（dendritic cells，DC）和細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer，CIK）為主的免疫細胞治療被應用于預防原發(fā)性肝臟淋巴瘤和進展性腎癌術(shù)后復發(fā)，并取得了顯著的療效[4-5]。本研究將DC-CIK免疫細胞治療與吡柔比星膀胱內(nèi)灌注治療聯(lián)合用于預防膀胱癌術(shù)后復發(fā)，并探討了其對術(shù)后患者生存率等的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 我院于2009年6月到2012年6月共收治淺表性膀胱癌手術(shù)患者122例。入選標準：①患者術(shù)前均通過膀胱鏡檢查和病理學確診；②均為初發(fā)腫瘤患者；③所有患者術(shù)后治療均簽署知情同意書。122例患者按照術(shù)后治療方式分為對照組和觀察組，對照組53例，其中男28例，女25例；年齡26～80歲，平均（62.5±12.1）歲；腫瘤單發(fā)43例，多發(fā)10例；手術(shù)方法：經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)32例，經(jīng)尿道膀胱腫瘤汽化術(shù)13例，接觸式激光膀胱腫瘤切除術(shù) 8例；術(shù)后病理分期：Ta25例，T119例，Tis9例。觀察組69例，其中男39例，女30例；年齡25～82歲，平均（63.1±12.6）歲；腫瘤單發(fā)62例，多發(fā)7例；手術(shù)方法：經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)46例，經(jīng)尿道膀胱腫瘤汽化術(shù)12例，接觸式激光膀胱腫瘤切除術(shù)11例；術(shù)后病理分期：Ta34例，T121例，Tis14例。兩組患者年齡、性別、腫瘤數(shù)量、手術(shù)方式及術(shù)后病理分期比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DC-CIK細胞的體外擴增：采用血細胞分離機從患者外周血中分離單個核細胞，用淋巴細胞分離液進行純化后，細胞貼壁培養(yǎng)2 h。收集未貼壁的細胞，貼壁的細胞加入含GM-CSF 1000 U/mL、IL-4 500 U/mL、TNF-α500 U/mL的PRMB 1640培養(yǎng)基，每4 d更換培養(yǎng)基1次，連續(xù)培養(yǎng)8～12 d后即為DC。將上述未貼壁細胞濃度調(diào)整為2.5×106/mL，加入INF-γ1000 U/mL，第2天加入IL-1α100 U/mL、IL-2500 U/mL、CD3單抗50 ng/mL，每3 d更換培養(yǎng)基1次，連續(xù)培養(yǎng)8～12 d后即為CIK細胞。將培養(yǎng)第9天的DC和CIK細胞按照1:5比例混合培養(yǎng)3 d，開始回輸。

細胞回輸質(zhì)控標準：培養(yǎng)第9天流式細胞術(shù)檢測CIK細胞CD3+CD56+≥50%，CD3+CD8+≥30%; DC CD80+、CD83+、CD86+、CD1α+、HLA-DR+細胞比例≥50%；細胞活力≥95%；不含細菌和內(nèi)毒素。

1.2.2 對照組治療方法：對照組給予膀胱內(nèi)灌注吡柔比星治療。方法如下：患者術(shù)后1周開始予吡柔比星（10 mg/支，深圳萬樂藥業(yè)有限公司）30 mg/次膀胱內(nèi)灌注，1周1次，共10次，此后每個月灌洗1次，連續(xù)灌洗10個月，總療程為12個月。

1.2.3 觀察組治療方法：患者術(shù)后先接受10周的膀胱內(nèi)灌注吡柔比星（即術(shù)后1周開始30 mg/次劑量行膀胱灌注，1周1次，共10次），然后靜脈輸注DC-CIK細胞5×109/次，連續(xù)輸注3 d，1次/d，3次為一個療程。此后膀胱內(nèi)灌注吡柔比星化療每月1次，在每2個月化療間隙給予患者一個療程的DCCIK免疫細胞治療，總療程為12個月，其中DC-CIK治療總計5個療程。

1.3 觀察指標及評定標準 分別對兩組術(shù)后累積復發(fā)率、累積生存率、不良反應及患者的免疫功能進行評定。免疫功能評定方法：分別在治療前后采集患者外周血，采用流式細胞術(shù)對患者外周血CD3、CD4、CD8陽性細胞的比例進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以 ±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組術(shù)后累積復發(fā)率和生存率比較 對照組術(shù)后1年和2年累積復發(fā)率分別為33.96%和73.58%，觀察組術(shù)后1年和2年累積復發(fā)率分別為18.18%和55.07%，如圖1A所示。對照組術(shù)后1年和2年累計生存率分別為33.96%和45.28%，觀察組術(shù)后1年和2年生存率分別為4.47%和26.09%，如圖1B所示。

2.2 兩組患者治療前后免疫功能分析 結(jié)果如表1所示，對照組和觀察組術(shù)后接受治療前外周血CD3、CD4和CD4/CD8比值等指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組術(shù)后接受膀胱內(nèi)灌注吡柔比星治療后外周血CD3、CD4和CD4/CD8比值等指標較治療前有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。觀察組術(shù)后接受細胞免疫治療和膀胱內(nèi)灌注吡柔比星治療后CD3、CD4和CD4/CD8比值等指標較治療前和對照組術(shù)后明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。兩組CD8治療前后差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 兩組不良反應比較 對照組24例出現(xiàn)不良反應，主要表現(xiàn)為尿急、尿頻和尿痛等；觀察組20例出現(xiàn)不良反應，以尿急、尿頻和尿痛為主。DC-CIK治療并未引起明顯不良反應。

圖1 兩組患者治療后累積復發(fā)率和生存率比較

表1 兩組術(shù)后治療前后外周血CD3、CD4和CD4/CD8比值變化

3 討論

膀胱癌近年來發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，位居泌尿系統(tǒng)腫瘤首位。膀胱癌手術(shù)后腫瘤的復發(fā)率極高，且部分患者復發(fā)后出現(xiàn)腫瘤分期、分級提高，浸潤能力增強，給后期治療帶來了困難，也嚴重縮短了患者的生存時間。

吡柔比星是常用的膀胱內(nèi)灌注化療藥物之一，其屬于葸環(huán)類抗腫瘤抗生素，可進入腫瘤細胞抑制DNA合成，使腫瘤細胞增殖終止于G2期，最終使腫瘤細胞凋亡和壞死。吡柔比星在腫瘤細胞中擴散速度快，通過膀胱內(nèi)灌注可有效進入腫瘤細胞，消除原位腫瘤殘余病灶，達到預防術(shù)后復發(fā)的目的[6-7]。單純膀胱內(nèi)灌注吡柔比星預防淺表性膀胱癌術(shù)后復發(fā)雖有效果，但是術(shù)后復發(fā)率仍然較高。

DC-CIK細胞免疫療法是目前較為理想的過繼免疫治療方案[8]。DC是人體內(nèi)功能最強且是唯一能呈遞蛋白質(zhì)抗原的抗原遞呈細胞，可有效誘導機體抗腫瘤免疫反應[9]。CIK細胞具有與細胞毒T淋巴細胞相似的殺腫瘤細胞活性，其不受機體主要組織相容抗原（MHC）的限制，可以非特異性識別靶細胞，殺傷腫瘤細胞[10]。

本研究將吡柔比星膀胱內(nèi)灌注化療與DC-CIK細胞免疫療法相結(jié)合，分析了其對淺表性膀胱癌患者術(shù)后復發(fā)和生存情況的影響，結(jié)果顯示膀胱內(nèi)灌注吡柔比星與DC-CIK聯(lián)合治療患者術(shù)后復發(fā)率明顯下降，而生存率明顯升高，提示DC-CIK聯(lián)合膀胱內(nèi)灌注吡柔比星對于淺表性膀胱癌術(shù)后復發(fā)有較好的療效。腫瘤患者存在機體免疫力低下和功能紊亂，表現(xiàn)為CD3+、CD4+陽性T淋巴細胞比例下調(diào)，CD4/CD8比值明顯下降[11]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者在接受DC-CIK細胞免疫治療后CD3+、CD4+陽性T淋巴細胞比例及CD4/CD8比值明顯增加，提示患者機體免疫功能提高，對殺傷殘留腫瘤細胞，降低術(shù)后復發(fā)率具有重要的意義。

綜上所示，DC-CIK聯(lián)合膀胱內(nèi)灌注吡柔比星可顯著降低表淺性膀胱癌術(shù)后復發(fā)率，提高患者術(shù)后生存率，值得臨床推廣使用。

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