張 芮 王一兵 林 莉 王法剛 李 強(qiáng) 曹永倩

(1.山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理教研室，山東 濟(jì)南 250002；2. 山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院燒傷整形美容外科, 山東 濟(jì)南 250021)

作為一種細(xì)胞骨架蛋白，支架蛋白IQGAP1在細(xì)胞的多種生物學(xué)行為中發(fā)揮重要功能，通過調(diào)節(jié)多種信號傳導(dǎo)途徑在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和增殖中扮演重要的角色；并與多種惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。為探討IQGAP1在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲中的作用機(jī)制，我們構(gòu)建針對IQGAP1基因的RNA干擾(RNAi)的慢病毒載體，高效、特異、穩(wěn)定地抑制IQGAP1基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1材料

PCR用試劑primer(生工生物工程上海有限公司)，Positive clone測序(Invitrogen公司)，Taq polymerase(NEB公司)，DMEM+ 10% 胎牛血清(GIBICO公司)，高純度質(zhì)粒抽提試劑盒(QIAGEN公司)，DNA ladder、EcoR I、T4 DNA ligase(Fermentas公司)。

1.2慢病毒干擾載體的構(gòu)建

針對目的基因靶基因序列，根據(jù)Genbank中人IQGAP1(NM_003870)的基本信息，設(shè)計(jì)4個(gè)RNA 干擾靶點(diǎn)序列，分別為No.1: CAGTAATCTACATTTCCAT, No.2: CATCCACTTACCAGGATAT, No.3:GGATGAAGCCGCATTACATGC, No.4:GCCCAGCAATATCAGAGAAGA。經(jīng)BLAST檢索，確認(rèn)除IQGAP1基因以外的已知基因無同源性，分別設(shè)計(jì)并合成4對shRNA寡聚單鏈DNA，退火成雙鏈后插入到慢病毒載體中，構(gòu)建4 個(gè)shRNA慢病毒重組質(zhì)粒。shRNA經(jīng)退火、酶切、回收后與引物連接，把連接產(chǎn)物全部加入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。過夜培養(yǎng)后，挑取若干個(gè)單菌落，測序鑒定陽性克隆。

1.3慢病毒載體沉默效果的驗(yàn)證

用QIAGEN高純度質(zhì)粒抽提試劑盒制備構(gòu)建4條shRNA慢病毒載體質(zhì)粒，將狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的空白細(xì)胞293T細(xì)胞，按照每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿，24 h細(xì)胞覆蓋70%～80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h收集細(xì)胞抽提蛋白，采用Western blot檢測目的蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)而判斷shRNA慢病毒載體對不同靶點(diǎn)的干擾效果。

1.4慢病毒的包裝和病毒滴度的測定

抽取shRNA載體及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，使用HG transgene reagent 將構(gòu)建好的慢病毒shRNA載體及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染10～12 h 后加Enhancing buffer，接著8 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，在293T 細(xì)胞中測定病毒滴度。

2 結(jié) 果

2.1陽性克隆測序結(jié)果

經(jīng)過比對，重組克隆中插入片段序列與設(shè)計(jì)的oligo序列完全一致，因此IQGAP1-shRNA 慢病毒載體構(gòu)建成功(圖1,2)。

圖1 pGMLV-SB1RNAi 慢病毒載體圖譜

IQGAP1-shRNA1

IQGAP1-shRNA2

IQGAP1-shRNA3

IQGAP1-shRNA4

2.2Western blot 方法檢測轉(zhuǎn)染后IQGAP1基因的表達(dá)水平

以β-actin作為內(nèi)參對照，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后IQGAP1蛋白表達(dá)條帶?？梢妼?shí)驗(yàn)組IQGAP1蛋白表達(dá)量減少，IQGAP1-shRNA3沉默效果明顯，為有效靶點(diǎn)(圖3)，以此進(jìn)行病毒包裝。

圖3 轉(zhuǎn)染后IQGAP1基因的表達(dá)水平

2.3慢病毒shRNA感染細(xì)胞96 h后部分孔的熒光照片 如圖4。

圖4 慢病毒shRNA感染細(xì)胞96 h后熒光照片

A為含有10×10-9ml的慢病毒原液，B為含有10×10-10ml的慢病毒原液

IQGAP1-shRNA3 病毒感染293T細(xì)胞，B號孔中觀察表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞至少為20個(gè)，則病毒的滴度為:20TU/10×10-10ml =2×1010TU/ml,可以作為貯存液用于后續(xù)的研究。

3 討 論

近年來IQGAP1蛋白在惡性腫瘤中的研究是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，高表達(dá)的IQGAPl蛋白能夠破壞細(xì)胞間的粘附連接，降低細(xì)胞間的粘附力，并且顯著增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力[1]，而這二者在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中處于核心地位。IQGAP1作為Rac1/Cdc42信號通路和肌動(dòng)蛋白動(dòng)力的調(diào)節(jié)者[2]，被認(rèn)為是細(xì)胞遷移的重要調(diào)節(jié)者[3-5]。同時(shí)通過影響E-cadherin介導(dǎo)的上皮細(xì)胞間的粘附連接，降低細(xì)胞間的粘附性[6]。細(xì)胞間粘附力降低，可以使腫瘤細(xì)胞更容易從細(xì)胞集落中脫落下來，進(jìn)入血流和周圍組織。

IQGAP1 在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)明顯增高[7-8]，并且在惡性膠質(zhì)瘤病人中已作為判斷預(yù)后的重要標(biāo)志之一。在侵襲性高的卵巢腺癌組織中IQGAP1的表達(dá)比在腺瘤或交界性瘤組織中的表達(dá)明顯增高[9]。在胃癌病人中，IQGAP1的低表達(dá)提示預(yù)后良好[10]。Jun J等[11]利用免疫組化的方法觀察鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤(IP)、鼻竇鱗狀細(xì)胞癌(SCC)及二者兼有的標(biāo)本(IPcSCC)，發(fā)現(xiàn)SCC和IPcSCC組織中IQGAP1的表達(dá)量比IP組織和非腫瘤性疾病中明顯增高；在SCC病人中，IQGAP1的表達(dá)與局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此通過各種手段沉默敲除或下調(diào)IQGAP1的表達(dá)，研究其對腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響是倍受重視的研究思路。但目前關(guān)于應(yīng)用RNA干擾手段沉默表達(dá)IQGAP1的報(bào)道還比較少見，因此我們構(gòu)建了IQGAP1-RNAi的慢病毒載體系統(tǒng)，用于轉(zhuǎn)染IQGAP1表達(dá)較高的腫瘤細(xì)胞，觀察其對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響。

RNA干擾是由雙鏈RNA(dsRNA)轉(zhuǎn)化成小分子干擾RNA(siRNA)所介導(dǎo)的一種基因沉默的過程[12]，小片段的siRNA可以誘導(dǎo)高效的基因沉默。因此利用RNAi來阻斷目的基因的表達(dá)，是目前基因治療和基因功能研究的熱點(diǎn)之一[13-14]。

細(xì)胞基因修飾的常用載體有非病毒轉(zhuǎn)移載體和基因修飾病毒載體，前者包括質(zhì)粒、寡核苷酸等，但存在轉(zhuǎn)移效率低、細(xì)胞膜損傷等缺點(diǎn)。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒等，完全缺失致病基因的慢病毒(lentivirus)載體具有很高的安全性[15]，對于分裂或非分裂細(xì)胞均有較高的感染能力，能夠使目的基因整合到宿主的基因組，為靶基因的沉默穩(wěn)定、持久提供了有力保障[16-17]?？娠@著提高RNAi的抑制效率，慢病毒載體作為新一代高效表達(dá)載體推進(jìn)了腫瘤的基因治療。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)出GC含量在32%～48%的4個(gè)shRNA序列，連接慢病毒載體pGMLV-SB1，測序鑒定后，將構(gòu)建重組的載體和慢病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過Western blot證明在293T細(xì)胞中成功抑制了IQGAP1的表達(dá)，并在293T細(xì)胞中成功包裝出entivirus-IQGAP1-shRNA病毒，測定病毒滴度達(dá)2×1010TU/ml；為RNAi用于靶向IQGAP1的基因治療提供了有效的siRNA序列,為腫瘤的基因診斷和治療開啟了一扇窗。

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