殷津津 宋麗陽(yáng) 楊 杰 岳 旺 張繼國(guó)

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，山東 青島 266021； 2.泰山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東 泰安 271016)

細(xì)菌感染是臨床上常見(jiàn)的病癥，但現(xiàn)有的大多抗菌藥物存在特異性低、毒性大、易耐藥等缺點(diǎn)，而且大多數(shù)抗菌西藥價(jià)格昂貴。從海洋生物次生代謝產(chǎn)物中已篩選出大量抗菌活性成分[1]，但臨床應(yīng)用的先導(dǎo)化合物仍較少。

吲哚-2，3-二酮(靛紅，isatin，ISA)是來(lái)自于龍蝦并維持其生存所必需的一種天然海洋活性物質(zhì)[2]，現(xiàn)已證明它也是存在于海洋生物、中藥青黛和人體內(nèi)的天然活性物質(zhì)，為成分單一的橙紅色有機(jī)天然物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，單體已可合成。實(shí)驗(yàn)研究已表明，ISA有抗炎[3]、抗病毒[4]、抗腫瘤[5]、免疫增強(qiáng)[6]等作用，但未見(jiàn)ISA在抗菌作用方面的報(bào)道，本研究通過(guò)吲哚-2,3-二酮的體內(nèi)外抗菌實(shí)驗(yàn)，研究ISA的抗菌作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

金黃色葡萄球菌(ATCC6032)、大腸埃希菌(ATCC8099)、吲哚-2,3-二酮片、二甲基亞砜、純化水、培養(yǎng)皿、無(wú)菌試管、營(yíng)養(yǎng)肉湯、眼科鑷子、玻璃棒、無(wú)菌棉簽、培養(yǎng)箱、游標(biāo)卡尺、磺胺嘧啶、純化水、西黃蓍膠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明種小鼠，由青島市藥檢所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1體外抑菌試驗(yàn)

采用瓊脂擴(kuò)散法，將各供試菌液標(biāo)化，15 min內(nèi)接種于培養(yǎng)基上，接種方法是用滅菌棉簽沾取菌液,在平板上向一個(gè)方向均勻涂布,然后將平皿轉(zhuǎn)動(dòng)60°，再涂布1 次，重復(fù)3次, 最后沿平板邊緣涂布1 周。加蓋放置5 min，待平皿面稍干，用無(wú)菌眼科鑷子將經(jīng)過(guò)提取物浸潤(rùn)的藥敏片均勻間隔貼于瓊脂培養(yǎng)基表面，并輕壓紙片，使其與培養(yǎng)基接觸良好，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24 h，取出，觀察抑菌圈大小，測(cè)量并記錄結(jié)果。測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)，選均勻而完全無(wú)菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)行測(cè)量,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑，并記錄測(cè)量數(shù)據(jù)。

1.3.2最小抑菌濃度(MIC) 測(cè)定試驗(yàn)

采用試管稀釋法。根據(jù)體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合提取物的溶解性,取無(wú)菌試管10支(15 ×100 mm),每管加入適宜的肉湯(接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯) 2 ml ,在第1 管加入配好的提取物原液(12 mg/ ml) 2 ml ,然后吸取2 ml 至第2 管,混勻后再吸取2 ml 至第3 管,如此連續(xù)倍比稀釋至第8 管,并從第8 管中吸取2 ml棄去,第9 管為不含提取物的生長(zhǎng)對(duì)照,只加入肉湯2 ml ,第10 管為提取物對(duì)照,只加入提取物原液2 ml ,不加肉湯和細(xì)菌。使各管提取物濃度依次為原液濃度的1/2 、1/4 、1/8 、1/16 、1/32 、1/64 、1/128 、1/256。在每管內(nèi)加入制備好的菌懸液各0.1 ml。第1 管至第8 管提取物濃度依次為6.00、3.00、1.50、0.75、0.375、0.1875、0.09375、0.046875 mg/ ml。接種完畢后,各試管加塞,置37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)18～24 h，試驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果判定：以肉眼觀察,不發(fā)生混濁變化的最高提取物稀釋倍數(shù)為該提取物的MIC。

1.3.3最小殺菌濃度(MBC) 測(cè)定試驗(yàn)

選用已經(jīng)定出MIC 的各組,將組內(nèi)所有清晰無(wú)菌生長(zhǎng)的試管培養(yǎng)液各取出100 μl，加入到適宜的瓊脂培養(yǎng)基上，用滅菌L 型玻璃棒涂布均勻，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)18～24 h，重復(fù)3 次。結(jié)果判定：以菌落數(shù)不超過(guò)5 個(gè)的最低提取物濃度為該提取物的MBC。

因吲哚-2，3-二酮不溶于水，微溶于二甲基亞砜，而二甲基亞砜本身有一定的殺菌作用 。為了證明二甲基亞砜溶劑對(duì)吲哚-2，3-二酮抑菌結(jié)果有無(wú)影響，將二甲基亞砜純?cè)噭┡c吲哚-2，3-二酮含量為12mg/ml的二甲基亞砜溶液，按相同稀釋倍數(shù)稀釋成不同濃度作對(duì)照試驗(yàn)。

1.3.4動(dòng)物分組與處理

將吲哚-2，3-二酮和磺胺嘧啶溶于1.25%的西黃蓍膠，配成吲哚-2，3-二酮10、25、62.5 mg/kg的混懸液，磺胺嘧啶配成200 mg/kg的混懸液。取小鼠100只，隨機(jī)均分成5組，每組20只：西黃蓍膠組、ISA低中高劑量組(ISA 10、25、62.5 mg/kg)和磺胺嘧啶組(200 mg/kg)，分別灌胃給藥(每只0.25 ml)，連續(xù)9天。于第9天給藥后40 min，各組小鼠10只腹腔注射金黃色葡萄球菌菌液1.0 ml(1×109CFU/ml)，另外10只腹腔注射大腸桿菌液1.0 ml(1×109CFU/ml)，觀察小鼠的死亡情況，連續(xù)5天。

2 結(jié) 果

2.1 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

可看出，當(dāng)ISA濃度為75 mg/ml時(shí)，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同濃度吲哚-2，3-二酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.2 最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)

可看出，當(dāng)ISA濃度為750 ;μg/ml時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無(wú)生長(zhǎng)，說(shuō)明ISA對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為750 μg/ml。見(jiàn)表2。

表2 吲哚-2，3-二酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC

注：+表示有細(xì)菌生長(zhǎng)，-表示抑菌。

2.3 MBC

可看出，當(dāng)ISA濃度為3000 μg/ml時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無(wú)生長(zhǎng)，說(shuō)明ISA對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度為3000 μg/ml。還觀察到二甲基亞砜溶劑稀釋至ISA含量為1.5 mg/ml的相同倍數(shù)時(shí)沒(méi)有抑菌(對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均相同)效果。本試驗(yàn)所用ISA的最高稀釋濃度為1.5 mg/ml，故二甲基亞砜溶劑對(duì)ISA的抑菌效果無(wú)影響。結(jié)果見(jiàn)表3。

體內(nèi)抗菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，25 mg/kg ISA可使大腸桿菌和金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的小鼠死亡率降低40%。見(jiàn)表4。

表 3 吲哚-2，3-二酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MBC

注：+表示有細(xì)菌生長(zhǎng)，-表示抑菌。

表4 吲哚-2，3-二酮對(duì)感染金黃色葡萄球菌和大腸桿菌小鼠的保護(hù)作用

注：分子為每組死亡小鼠數(shù)，分母為每組小鼠總數(shù)。

3 討 論

由細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體等多種病原微生物所致的感染性疾病遍布臨床各科，其中細(xì)菌性感染最為常見(jiàn)[7]，因此抗菌藥物也就成為臨床最廣泛應(yīng)用的藥物之一。但現(xiàn)有的大多抗菌藥物存在特異性低、毒性大、易耐藥等缺點(diǎn)。目前在生物次生代謝產(chǎn)物中已篩選出大量抗菌活性成分，但臨床應(yīng)用的先導(dǎo)化合物仍較少。對(duì)大量的海洋動(dòng)物提取物進(jìn)行抗細(xì)菌實(shí)驗(yàn)表明，鮑魚(yú)、牡蠣、硬殼蛤和某些腹足動(dòng)物提取物中的大分子化合物，在體內(nèi)、體外均顯示出抗菌活性。本研究通過(guò)體內(nèi)外抗菌實(shí)驗(yàn)，證明了海洋活性物質(zhì)吲哚-2,3-二酮具有抗菌作用，其最低抑菌濃度(MIC)在大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均為750 μg/ml，最低殺菌濃度(MBC)在大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均為3000 μg/ml。并且25 mg/kg吲哚-2，3-二酮可使大腸桿菌和金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的小鼠死亡率降低40%。

吲哚-2，3-二酮具有良好的抗菌作用，并且其毒性低，副作用小[7]，在制備抗菌藥物方面有良好的應(yīng)用前景。吲哚-2，3-二酮作為一種結(jié)構(gòu)明確的天然海洋活性物質(zhì)，毒性低，具有良好的抗菌消炎作用，這是目前人工合成抗菌藥物所不具有的優(yōu)點(diǎn)，有著巨大的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。

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