周劍 王錫山

我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤中第3位，且以每年4．2%的速度上升，5年生存率約為27%［1］。結(jié)直腸癌患者中早期診斷的患者僅約11%左右［2］，大多數(shù)患者在就診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多步驟多因素的復(fù)雜過程，具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)病灶，以極少的數(shù)量轉(zhuǎn)移到血液、骨髓、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官中，運(yùn)用常規(guī)的檢測(cè)手段難以發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象稱為腫瘤的微轉(zhuǎn)移(Micrometastasis)。腫瘤細(xì)胞的脫落、侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)是腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，并為最終形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶提供了可能。因此，在外周血中檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)逐漸成為臨床研究的熱點(diǎn)。本文就CTC在結(jié)直腸癌的檢測(cè)、應(yīng)用及新的研究方向等方面進(jìn)行綜述。

一、CTC概述

1869年，澳大利亞病理學(xué)家Ashworth在一例腫瘤患者的外周血中觀測(cè)到腫瘤細(xì)胞，認(rèn)為其為引起腫瘤轉(zhuǎn)移的原因之一，并首次提出了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的概念。CTC的定義是:外周血中由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放入血、具有腫瘤特異性抗原或基因特征的腫瘤細(xì)胞?，F(xiàn)今人們已在包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、食管癌等類型的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了CTC［3］。CTC的發(fā)現(xiàn)，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究及腫瘤診療有重大的意義。通過研究CTC可以發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的微妙變化，并能為患者的預(yù)后判斷、病情評(píng)估及治療反應(yīng)等方面提供參考。

二、CTC的形成與腫瘤轉(zhuǎn)移

CTC是指由實(shí)體腫瘤組織脫落并釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。獲得高侵襲性表型的原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞，侵犯周圍基質(zhì)并進(jìn)入血液循環(huán)，成為CTC。離開血液循環(huán)，進(jìn)入繼發(fā)臟器的局部微環(huán)境，逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視，到達(dá)遠(yuǎn)處臟器，存活并發(fā)生克隆增殖。如其能獲得充足的血供，最終將形成肉眼可見的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。CTC也可向骨髓歸巢，進(jìn)入骨髓儲(chǔ)備池并維持靜息狀態(tài)，在一定條件下可再次釋放入外周血循環(huán)，活化增殖形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶［4］。CTC與腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)間的關(guān)系已被眾多研究所證實(shí)［5］。CTC具有CSC的高度侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，此外上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)也是其生物學(xué)特征之一。腫瘤組織可招募一系列的基質(zhì)細(xì)胞，通過分泌大量細(xì)胞因子和趨化因子等，使鄰近細(xì)胞分化為誘導(dǎo)型腫瘤干細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)移潛能。部分具有高侵襲能力的CTC即來源于這些發(fā)生EMT的細(xì)胞。在此過程中，一系列的EMT靶基因受到調(diào)控，上皮細(xì)胞的標(biāo)志物如鈣黏蛋白、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)等表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物如彈性蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等表達(dá)顯著上調(diào)。這些標(biāo)志物表達(dá)含量的改變，意味著僅用上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物來定義CTC將會(huì)遺漏發(fā)生EMT的細(xì)胞，而該群細(xì)胞往往是CTC中最具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能的亞群。

三、結(jié)直腸癌CTC檢測(cè)的方法

1．免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry，ICC)法:ICC 是基于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的原理，將特異性的腫瘤標(biāo)志物與單克隆抗體相結(jié)合，通過酶與底物反應(yīng)顯色或其他顯色方法對(duì)腫瘤進(jìn)行定位、定性和定量測(cè)定的技術(shù)。ICC的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、直觀并可進(jìn)行細(xì)胞大小與形態(tài)學(xué)分析，把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。缺點(diǎn)是:(1)敏感性低，只能從105個(gè)正常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一個(gè)腫瘤細(xì)胞，而且腫瘤細(xì)胞表面抗原表達(dá)的不均一性，也在一定程度上降低了檢測(cè)的敏感性［6］。(2)許多分化差的腫瘤細(xì)胞不能表達(dá)目標(biāo)抗原、部分淋巴細(xì)胞交叉反應(yīng)等因素都會(huì)影響CTC檢測(cè)的特異性。(3)檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞抗原較高的表達(dá)豐度，而且鏡下對(duì)結(jié)果的觀察和判讀主觀性較強(qiáng)，限制了ICC在結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用。所以目前較少單獨(dú)應(yīng)用傳統(tǒng)的ICC方法檢測(cè)結(jié)直腸癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞。有學(xué)者提出用磁性細(xì)胞分選技術(shù)或密度梯度離心法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集后再用ICC檢測(cè)，目的是為了提高ICC檢測(cè)的敏感性和特異性。由此看出，磁性細(xì)胞分選技術(shù)與ICC相結(jié)合可以彌補(bǔ)技術(shù)上的不足，提高了CTC檢測(cè)的敏感性和特異性。

2流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM):FCM是一項(xiàng)集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光、電子物理、流體動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞熒光化學(xué)、單克隆抗體等方法為一體的新型技術(shù)，該技術(shù)主要是運(yùn)用標(biāo)記熒光物質(zhì)的單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞特異性的標(biāo)志物結(jié)合，使腫瘤細(xì)胞染色，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量分析［7］。FCM的優(yōu)點(diǎn)主要是可在免疫放大檢測(cè)CTC的同時(shí)對(duì)癌細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行定量測(cè)定，可以提供DNA倍數(shù)性的關(guān)系，而且測(cè)量速度較快，檢測(cè)數(shù)據(jù)較精確。同時(shí)，F(xiàn)CM還可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，并可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析與分選。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞需要將針對(duì)腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物的單克隆抗體結(jié)合熒光物質(zhì)(如異硫氰酸熒光素)等使腫瘤細(xì)胞染色，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，著色細(xì)胞即被視為陽性。Cohen等［8］人在研究結(jié)直腸癌患者時(shí)，利用FCM技術(shù)在每7．5ml血液中檢測(cè)出2個(gè)CTC，而且結(jié)果顯示CTC的檢出率與病理分期有顯著的相關(guān)性，這對(duì)結(jié)直腸癌微轉(zhuǎn)移的診斷具有一定的臨床意義。同時(shí)，Cohen發(fā)現(xiàn)，CTC在治療前后數(shù)目的變化與影像學(xué)聯(lián)合應(yīng)用也可以作為判斷結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的重要因素。FCM在CTC檢測(cè)方面的局限性:(1)缺乏規(guī)范的操作方法，價(jià)格昂貴且時(shí)間較長(zhǎng)，不同文獻(xiàn)報(bào)道的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的結(jié)果差異很大。(2)標(biāo)本固定貯存及研究人員間的差異因素的干擾。(3)FCM的敏感性較低。檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的價(jià)值在很大程度上依賴于可分析的細(xì)胞數(shù)量［9］。FCM檢測(cè)靶細(xì)胞的敏感度僅為1×104，而外周血中腫瘤細(xì)胞數(shù)量常少于1×106，因此受篩檢細(xì)胞數(shù)的限制，單純依靠FCM檢測(cè)微轉(zhuǎn)移的方法有一定的局限性，而主要用于骨髓微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)和有明顯轉(zhuǎn)移的進(jìn)展期患者外周血的腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)［10］。有文獻(xiàn)指出，將FCM與其他細(xì)胞富集技術(shù)聯(lián)用可對(duì)CTC進(jìn)行特異性富集，提高方法的敏感性和鑒別力，可使CTC的檢出率更高［11］。

3．免疫磁珠分離檢測(cè)法:免疫磁珠分離技術(shù)(immunomagnetic separation，IMS)是近年來國(guó)內(nèi)外研究的一種新的免疫學(xué)技術(shù)，它能夠從大量外周血中篩選出帶有特異性標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞。免疫磁珠是均勻的、球狀的、具有超順磁性及保護(hù)殼的微粒。其基本原理主要是細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，形成抗原－抗體－磁珠免疫復(fù)合物，該復(fù)合物在外加磁場(chǎng)的作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，將含有靶抗原的目的細(xì)胞與其他細(xì)胞分離，從而達(dá)到特異性分離細(xì)胞的目的［12］。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于分選過程中避免了細(xì)胞溶解，降低了后續(xù)鑒定工作中的干擾因素，并可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、染色、核酸分析以及藥物敏感實(shí)驗(yàn)。免疫磁珠分離技術(shù)包括陽性分選和陰性分選兩種方法。陽性分選即與磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的靶細(xì)胞;陰性分選則利用免疫磁珠去除無關(guān)細(xì)胞，游離于上清液的細(xì)胞為所需細(xì)胞。在試驗(yàn)中，技術(shù)人員多將陽性分選與陰性分選相結(jié)合以進(jìn)一步降低血細(xì)胞的含量，提高富集效率。有報(bào)道稱該技術(shù)的富集效率與一般的分離方法相比可提高1×103～1×104倍［13］。有研究人員將免疫磁珠與免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)等方法相聯(lián)合起來檢測(cè)CTC，大大彌補(bǔ)了這些檢測(cè)技術(shù)所存在的缺陷，提高了這些檢測(cè)技術(shù)的敏感性和特異性。實(shí)驗(yàn)證明IMS與上述方法聯(lián)合后提高了靈敏度和特異性，而且方便快捷，同時(shí)提高了癌細(xì)胞的檢測(cè)率，將可能有助于早期腫瘤患者微轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)、術(shù)后患者腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的檢測(cè)、預(yù)后評(píng)估、治療策略的選擇以及臨床分期的重新確定［14］。但該技術(shù)在富集CTC的有效率以及檢測(cè)微轉(zhuǎn)移的研究中仍存在一些問題，例如受試者的炎癥性疾病、組織創(chuàng)傷、樣本中非腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)以及手術(shù)干預(yù)、采血時(shí)的操作都會(huì)得出假陽性的結(jié)果;而分離過程中CTC的丟失、循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞的高度異質(zhì)性等因素則會(huì)造成假陰性的結(jié)果。

4．cellsearch系統(tǒng):cellsearch系統(tǒng)是惟一被美國(guó)美國(guó)食品藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于臨床檢測(cè)CTC的技術(shù)，是目前自動(dòng)化程度最高的CTC檢測(cè)技術(shù)。受人為因素影響較小，該系統(tǒng)集免疫磁珠富集技術(shù)和免疫熒光技術(shù)于一體，具有較高的特異性、敏感性及可重復(fù)性，是基于免疫學(xué)原理的檢測(cè)方法。首先，cellsearch系統(tǒng)利用EPCAM抗體磁珠富集CTC，然后在外加磁場(chǎng)的作用下對(duì)血液中提取、分離出來的CTC進(jìn)行通透、固定，再用DAPI熒光核染料、CD45熒光抗體和CK8、CK18以及CK19熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞，最后采用半自動(dòng)四色熒光顯微鏡Cell-Spotter Analyzer檢測(cè)分析［15］。系統(tǒng)的這種半自動(dòng)特征使得樣本的檢測(cè)非常迅速，而且具有很好的重復(fù)性。cellsearch系統(tǒng)所需的血液樣本在含有一種特殊防腐劑的試管中存放72h后，仍能檢測(cè)到精確的CTC數(shù)目，表明該方法的敏感性很高，而且只需7．5ml血液樣本，即可從400多億血細(xì)胞中檢測(cè)到一個(gè)CTC［16］。劉志東等［17］研究發(fā)現(xiàn)外周血CTC的存在可被視為腫瘤TNM分期的MX狀態(tài)，作為精確臨床分期的必要補(bǔ)充，有利于對(duì)患者的預(yù)后作出更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。Sastre等［18］使用cellsearch系統(tǒng)檢測(cè)大腸癌患者CTC，結(jié)果顯示CTC陽性(CTC≥2個(gè))率與原發(fā)腫瘤部位、癌胚抗原、乳酸脫氫酶升高水平及腫瘤分化程度無關(guān)，但與結(jié)腸癌的臨床分期有關(guān)，且CTC在結(jié)腸癌的早期階段即可檢測(cè)到，表明CTC檢測(cè)有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌及可能出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移。然而，cellsearch系統(tǒng)操作步驟繁瑣，技術(shù)要求高，價(jià)格昂貴，并且只能檢測(cè)出EPCAM抗體陽性的CTC。因此，目前仍沒有大規(guī)模的應(yīng)用于臨床。

5．聚合酶鏈反應(yīng):(polymerase chain reaction，PCR)主要是通過檢測(cè)癌基因、抑癌基因的突變或染色體重排產(chǎn)生的異常DNA。此方法雖然敏感性高，但易出現(xiàn)假陽性，且適用范圍比較有限。此外，由于外周血中的CTC和核酸的半衰期不穩(wěn)定，檢測(cè)到的游離DNA可能僅僅是核酸而非真正的腫瘤細(xì)胞。因此應(yīng)用PCR技術(shù)通過DNA標(biāo)記指標(biāo)檢測(cè)CTC的特異性不高，在臨床實(shí)踐中尚不能達(dá)到理想的效果［19］。

6．逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR):此技術(shù)以腫瘤和上皮組織中某種物質(zhì)的mRNA為標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞。RT-PCR及其各種改進(jìn)的技術(shù)目前在循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛，且被認(rèn)為是目前檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞最有效的方法。RT-PCR檢測(cè)CTC是在PCR的基礎(chǔ)上擴(kuò)增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA片段，從而識(shí)別組織或腫瘤特異性mRNA的表達(dá)或某些基因改變后RNA水平的異常。由于這些特異性mRNA通常不表達(dá)于正常外周血細(xì)胞，且半衰期較短，在細(xì)胞死亡后會(huì)迅速被RNA酶降解，因此在外周血中檢測(cè)到的這些特異性mRNA可以間接提示CTC的存在［20］。

7．光纖陣列掃描技術(shù)法:此方法將外周血的細(xì)胞固定于玻片，無需進(jìn)行CTC富集純化，采用自動(dòng)化數(shù)字顯微鏡以30萬個(gè)細(xì)胞/s的速度進(jìn)行高速掃描，在玻片上直接定位經(jīng)熒光探針標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞。該法具有高通量、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。由于其探針也采用上皮細(xì)胞標(biāo)記，故同樣無法鑒定出EMT 的腫瘤細(xì)胞［21］。

四、CTC與結(jié)直腸癌手術(shù)的關(guān)系

手術(shù)操作的影響會(huì)影響患者術(shù)后早期CTC數(shù)目，此時(shí)的CTC數(shù)目不具有預(yù)后意義［22］。如果術(shù)后1周CTC仍存在，則成為術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)信號(hào)［23］。CTC既可來源于腫瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶，又可來自微轉(zhuǎn)移灶［24］。有報(bào)道稱進(jìn)行經(jīng)直腸超聲檢查可使結(jié)直腸癌患者的CTC水平較檢查前升高，且這一部分患者預(yù)后較差［25］，提示超聲探頭對(duì)腫瘤的擠壓，可能會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向外周血擴(kuò)散。由此聯(lián)想到腸鏡、結(jié)腸三維重建CT、盆腔核磁等應(yīng)用結(jié)直腸癌定位、定性診斷中同樣存在腫瘤細(xì)胞脫落的可能性。由此可見在對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行各種診療操作時(shí)，應(yīng)注意避免腫瘤細(xì)胞的醫(yī)源性血液播散［26］。

五、CTC在結(jié)直腸癌化療中的作用

CTC可作為患者化療敏感性的指標(biāo)之一，CTC的持續(xù)存在常常提示腫瘤對(duì)化療不敏感，CTC在患者化療過程中的變化，是決定患者化療敏感性及預(yù)后的因素之一，可作為結(jié)直腸癌患者個(gè)體化治療的一個(gè)參考［27}。

六、CTC與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

隨著結(jié)直腸癌患者的疾病進(jìn)展，CTC陽性率逐漸增加［28}。外周血中CTC的數(shù)目與患者的5年生存率成反比關(guān)系，并且是結(jié)直腸癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可用于判斷出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)［29］。與常規(guī)的腫瘤標(biāo)記物(CEA/CA199)相比，CTC對(duì)結(jié)直腸癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的警示要比CEA早大約12個(gè)月。

七、直腸癌CTC檢測(cè)的臨床意義

現(xiàn)今結(jié)直腸癌的臨床分期主要是依據(jù)TNM和Dukes分期標(biāo)準(zhǔn)，并不包括外周循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞。一般認(rèn)為，結(jié)直腸癌在轉(zhuǎn)移的形成過程中，腫瘤細(xì)胞在到達(dá)遠(yuǎn)處器官之前必先在血液中循環(huán)。雖然并非所有循環(huán)中的癌細(xì)胞均能存活，但循環(huán)性癌細(xì)胞與腫瘤患者的復(fù)發(fā)和不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，檢測(cè)結(jié)直腸癌患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的狀態(tài)，可以作為現(xiàn)有的腫瘤臨床分期方法的補(bǔ)充，從而精確腫瘤分期，更準(zhǔn)確判斷預(yù)后。檢測(cè)結(jié)直腸癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的狀態(tài)可以區(qū)別部分早期患者，采取針對(duì)性的治療措施［30］。

綜上所述，大量研究證實(shí)CTC與結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，檢測(cè)CTC有助于結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的早期診斷、臨床分期、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷，并為結(jié)直腸癌患者個(gè)體化治療提供臨床指導(dǎo)。當(dāng)然還存在很多爭(zhēng)議。(1)目前尚未發(fā)現(xiàn)特異性非常高的腫瘤標(biāo)志物。(2)CTC在循環(huán)中釋放是隨機(jī)的還是具有周期性和規(guī)律性。(3)缺乏有效的收集方法，因此會(huì)對(duì)收集的有效性和科學(xué)性造成影響，進(jìn)而可直接到影響結(jié)果的可信度。(4)眾多的檢測(cè)方法均缺乏公認(rèn)的檢測(cè)標(biāo)志、鑒定方法，尚無統(tǒng)一的規(guī)范。筆者認(rèn)為同一檢測(cè)方法，需保證患者準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、樣本處理的標(biāo)準(zhǔn)化，保證檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。不同檢測(cè)方法間，應(yīng)開展比對(duì)，并及時(shí)進(jìn)行結(jié)果分析。CTC檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，將有助于我們更深入的了解結(jié)直腸癌的生物學(xué)性征，動(dòng)態(tài)分析腫瘤分子的特性，更加及時(shí)、更加有效和更加完善的改善患者的預(yù)后，提高患者的生存率，為真正個(gè)體化治療提供依據(jù)。

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