郭妍 吳偉 劉巖 路箏 李兆申

·綜述與講座·

Twist基因在胰腺癌中的研究進展

郭妍 吳偉 劉巖 路箏 李兆申

Twist基因于1983年在研究果蠅胚胎異常發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后在多種動物體內(nèi)及人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了該基因的相似結(jié)構(gòu)。它是一種位于常染色體上的編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在不同種屬間其核苷酸和氨基酸序列高度保守，在小鼠和人類中其氨基酸序列具有96%的同源性。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Twist不僅在胚胎發(fā)育過程中對胚層的維持、穩(wěn)定起作用，而且在腫瘤轉(zhuǎn)移過程對細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞運動和遷移能力也起促進作用。Twist也是一種凋亡抑制蛋白，其過量表達往往預示著腫瘤的侵襲性增加、患者的生存率低和預后差，因它可促進細胞集落形成、阻止細胞凋亡、參與腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移。

胰腺導管腺癌(簡稱胰腺癌)是惡性程度最高的腫瘤之一，高居美國癌癥死亡原因的第4位[2]。上海市區(qū)胰腺癌標化發(fā)病率總體呈持續(xù)上升趨勢，從1973年的3.38/10萬上升至2007年的6.29/10萬，升高了86%，年度變化百分比(annual percentage change，APC)為1.8%(95%可信區(qū)間為1.5～2.0)[3]。大約40%的患者在診斷時就已發(fā)生局部浸潤或轉(zhuǎn)移，僅10%～20%的患者有機會接受手術(shù)治療，且胰腺癌對多數(shù)抗腫瘤治療如放療、化療和免疫治療不敏感，因此其預后差。如何早期診斷、早期治療是提高胰腺癌療效的關(guān)鍵。Twist作為近年來發(fā)現(xiàn)的癌相關(guān)基因，在腫瘤中的作用愈來愈受到關(guān)注，今后有可能為胰腺癌的診療提供新的方向。為此，本文對Twist及其在胰腺癌中研究進展做一綜述。

一、Twist的基本結(jié)構(gòu)與功能

在脊椎動物中存在2個Twist基因，分別為Twist1(即Twist)和Twist2(dermo-1)。人類的Twist基因位于7p21.2，mRNA序列全長1669 bp，其中包含2個外顯子和1個內(nèi)含子，其中第1個外顯子具有編碼蛋白質(zhì)的功能，編碼由202個氨基酸殘基組成的Twist蛋白。Twist蛋白分子量為26 000，等電點為9.591，是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic Helix-loop-Helix，bHLH)類型的轉(zhuǎn)錄因子，其可以與自身或者其他蛋白質(zhì)形成二聚體，并結(jié)合于特定的DNA序列E-box，使本來失活的單體形成同源或異源二聚體而獲得活性，在細胞核內(nèi)執(zhí)行轉(zhuǎn)錄激活或抑制功能。

人類Twist基因突變的類型多種多樣，包括無意義和錯意突變、移碼突變和長片段缺失突變等。這些突變可以導致多種疾病，其中最為典型的是尖頭并指(趾)畸形綜合征(Saethre-Chotzen syndrome)。它是一種常染色體的顯性遺傳病，臨床表現(xiàn)為顱縫早閉綜合征，包括尖頭畸形，同時伴有短指(趾)畸形、第2指間并指以及頜面畸形等[4]。

二、Twist與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)這一概念由Greenberg和Hay在1982年最早提出[5]，是指在某些特殊的生理或病理條件下上皮細胞表型的缺失及間質(zhì)特性的獲得，細胞的遷移和運動能力增強[6]。EMT現(xiàn)象在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生以及多種慢性疾病的發(fā)生過程中起重要作用，同時其與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程高度相關(guān)[7]。在EMT發(fā)生過程中，伴有多個細胞分子標志的改變，例如，上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、細胞角蛋白(Cytokeratin)、α-連環(huán)素(α-catenin)、β-連環(huán)素(β-catenin)、γ-連環(huán)素(γ- catenin)、橋粒斑蛋白、緊密連接蛋白、黏蛋白等表達下調(diào)，間質(zhì)表型標志物波形蛋白(vimentin)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、N-鈣黏素(N-cadhenin)、α-平滑肌動蛋白(α-SMA)等表達上調(diào)，誘導EMT發(fā)生的細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子Twist、Slug、Snail、TGF-β、Zeb、E47等表達上調(diào)。其中E-cadherin表達的變化在EMT過程中具有至關(guān)重要的作用[8]，其缺失在EMT中不僅被認為是癌細胞失去上皮特性的金標準，同時也是促進腫瘤轉(zhuǎn)移的重要表現(xiàn)，即導致細胞失去極性和細胞與細胞間的粘附作用不穩(wěn)定，以及細胞骨架的改變，從而實現(xiàn)細胞從原發(fā)灶中的分離。腫瘤形成局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移后，再次通過間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化定植形成轉(zhuǎn)移灶。

2004年，Yang等[9]首先經(jīng)體內(nèi)、體外研究證實Twist基因與EMT現(xiàn)象及腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，Twist在腫瘤轉(zhuǎn)移階段表達明顯增強，采用RNA干擾其表達后，乳腺癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的可能性降低。其可以通過轉(zhuǎn)錄水平啟動N-cadherin，間接作用于E-cadherin的合成，抑制其轉(zhuǎn)錄表達，促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移。同時Twist的表達上調(diào)可以直接與E-cadherin的啟動子結(jié)合，抑制E-cadherin的表達下調(diào)，促使腫瘤細胞發(fā)生EMT。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Twist是參與EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，在多種腫瘤細胞的增殖分化、轉(zhuǎn)移、侵襲以及抗凋亡等過程中起了重要作用[10-13]，與多種腫瘤例如乳腺癌、食管癌、胃癌及前列腺癌等[14-17]的病理分期、預后較差及轉(zhuǎn)移相關(guān)。

Satoh等[18]通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法獲得穩(wěn)定過表達MSX2的人胰腺癌細胞株BxPC3，結(jié)果顯示E-cadhenin和β-catenin的低表達。將此種細胞注射到裸鼠的胰腺內(nèi)，其肝臟和腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯增加。使用siRNA干擾MSX2的表達后，Twist的表達下調(diào)。因此該研究認為，MSX2的表達與胰腺癌分級、血管侵襲等密切相關(guān)，而這一過程是通過提高Twist的表達介導EMT發(fā)生而實現(xiàn)的。童玲等[19]采用免疫組織化學法分別檢測60例胰腺癌組織和20例癌旁正常胰腺中Twist及E-cadherin的表達，結(jié)果顯示Twist的異常表達與胰腺癌的侵襲、遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且與E-cadherin的表達負相關(guān)，對患者術(shù)后生存時間有顯著影響，可能是評估胰腺癌預后的潛在指標。Hotz等[20]將5株人胰腺癌細胞株(AsPC1、CaPan-1、HPAF-2、MiaPaCa-2和PANC1)暴露于缺氧環(huán)境48 h后，細胞Twist基因的表達均明顯增加。Twist在含氧量正常的腫瘤組織中不表達或微弱表達，而在缺氧條件下表達增加，亦提示Twist在胰腺腫瘤的侵襲行為中發(fā)揮重要的作用。然而，也有不同的研究結(jié)果存在。Cates等[21]采用組織芯片的方法對68例胰腺癌組織與38例正常胰腺組織及慢性胰腺炎組織進行免疫組化染色分析，結(jié)果顯示正常胰腺、慢性胰腺炎及胰腺導管腺癌組織中均有Twist表達。在胰腺癌組織中，癌細胞的核內(nèi)Twist水平較正常胰腺細胞降低。作者認為EMT相關(guān)因子的表達與胰腺癌患者的組織學分期、預后及生存期無相關(guān)性。

三、Twist與細胞凋亡

細胞凋亡是機體重要的生理過程，也是機體維持細胞數(shù)量穩(wěn)定的重要機制。當局部組織的細胞在基因水平上失去對其生長的調(diào)控，導致單克隆性異常增生，細胞增殖失控和細胞凋亡抑制，則很可能導致腫瘤的發(fā)生。Twist通過抑制ARF-p53依賴的通路觸發(fā)凋亡反應[22]。它與p53啟動子上的一個重要反式激活子HOXA5相互作用，并調(diào)節(jié)其活性；同時，在Twist過表達的乳腺癌MCF-7細胞中使p53對γ射線的反應降低，同時對下游靶基因的調(diào)控能力也降低，從而達到抑制凋亡的作用。采用小干擾RNA抑制非雄激素依賴的前列腺癌細胞株DU145和PC3中Twist的表達，可以激活凋亡通路，增加抗腫瘤藥物介導的細胞死亡。而此細胞系本身缺乏功能性的p53表達，因此表明Twist能夠通過p53依賴性或p53非依賴性的通路調(diào)控細胞凋亡[23]。

Twist蛋白也是受NF-κB調(diào)控的抗凋亡成分，對NF-κB起到抑制作用。一方面，NF-κB在下游接收Twist的調(diào)控而激活；另一方面，它還可以通過自身的轉(zhuǎn)錄因子活性促進Twist的表達。Twist作為NF-κB調(diào)控的保守的轉(zhuǎn)錄因子，可以阻止化療藥物和NF-κB缺陷細胞中TNF-α介導的細胞程序性死亡，對阻止腫瘤細胞的程序性死亡有重要的作用[24]。

四、Twist與腫瘤干細胞

近年來人們相繼在多種實體腫瘤中證實了腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)的存在[25-26]。CSCs是一群具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，雖然在腫瘤細胞總數(shù)中只占很小比例，但與腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移和治療失敗等密切相關(guān)。已經(jīng)有研究證實，胰腺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移均與胰腺癌干細胞相關(guān)。胰腺癌的標準化療方案的客觀反應率仍然較低，這可能是由于目前的標準化治療方案只是針對循環(huán)腫瘤細胞有效，而對CSCs的作用較弱有關(guān)[26]。表達干細胞相關(guān)標志物的細胞亞群已經(jīng)在多種實體腫瘤上發(fā)現(xiàn)，它們與腫瘤細胞的放化療抵抗相關(guān)。有研究[27]采用高濃度的吉西他濱干預胰腺癌細胞株，收集干預后耐藥存活的細胞，對包括Twist在內(nèi)的若干個腫瘤干細胞標志物和EMT標志物進行檢測。研究發(fā)現(xiàn)，在給予吉西他濱處理6 d后，所有的檢測指標均上調(diào)，胰腺癌細胞的遷移能力明顯增強，說明干細胞基因表達增強表現(xiàn)為EMT的發(fā)生以及細胞增殖能力的增強。另外，有研究報道[28]，采用siRNA干擾腫瘤干細胞標志物DCAMKL-1后發(fā)現(xiàn)，人胰腺癌細胞內(nèi)的EMT抑制因子miR-200a被活化，從而下調(diào)包括Twist在內(nèi)的多個EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，抑制了EMT的發(fā)生。

五、Twist與腫瘤的化、放療抵抗

化、放療在腫瘤的綜合治療當中占有相當重要的地位，但與之伴隨的腫瘤多藥耐藥性以及低放射敏感性在很大程度上影響并限制了腫瘤的治療。通過對腫瘤多藥耐藥性的機制研究，發(fā)現(xiàn)Twist通過調(diào)控EMT參與了這一過程。Frederick等[29]報道，EMT介導了頭頸部鱗癌、非小細胞肺癌對表皮生長因子吉非替尼(gefitinib)的耐藥過程。Li等[30]研究發(fā)現(xiàn)，不同結(jié)腸癌細胞株EMT特異性分子的表達量不同，其對化療藥物的敏感性也不同。Cheng等[31]指出，乳腺癌細胞系中有Twist轉(zhuǎn)錄上調(diào)時，腫瘤細胞的遷移侵襲以及對紫杉醇的耐藥性增加。在鼻咽癌細胞系及其耐藥株的研究中發(fā)現(xiàn)，Twist的上調(diào)使細胞獲得對紫杉醇的耐藥性[32]。Wang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌、膀胱癌、卵巢癌以及前列腺癌中，Twist水平的升高與這4種腫瘤對長春新堿的耐藥有相關(guān)性，并參與了鼻咽癌對紫杉醇的耐藥。Li等[12]報道，Twist的高表達與乳腺癌細胞株對阿霉素的耐藥有關(guān)。

同樣有研究表明，Twist也參與放療抵抗。Tsukamoto等[34]觀察到低劑量的照射可以誘導子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC1A發(fā)生EMT現(xiàn)象，同樣條件照射另一株子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa后，雖然也發(fā)生了EMT現(xiàn)象，但卻較HEC1A明顯輕微。進一步研究后證實，照射后HEC1A細胞E-cadherin的表達顯著降低，Twist表達顯著增高。

六、展望

綜上所述，Twist是參與EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與腫瘤發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移過程；并通過多種途徑實現(xiàn)凋亡抑制作用。另外，在腫瘤細胞耐藥以及放療抵抗中也發(fā)揮重要作用。然而，從目前來看，Twist在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及化、放療抵抗中的作用尚缺乏深入的研究，其分子調(diào)控機制尚不十分清楚。因此，進一步對Twist的深入研究，有可能將為胰腺癌的基因治療、抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的作用靶點，為患者制定新型的、合理的放療方案、改善患者的預后，提供新的理論依據(jù)。

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2013-01-04)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.025

國家自然科學青年基金(8001074)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內(nèi)科(郭妍、劉巖、路箏、李兆申)；石家莊解放軍66010部隊(吳偉)；郭妍現(xiàn)單位：解放軍第456中心醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email：zhaoshenli@hotmail.com